發(fā)布時(shí)間：2020-04-17所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：采用羅丹明B平板初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩法從含油脂豐富的土樣中篩選出產(chǎn)脂肪酶活性較高的菌株，并對(duì)活性最高的菌株TZ-1進(jìn)行16SrDNA鑒定和發(fā)酵產(chǎn)酶條件分析，發(fā)現(xiàn)TZ-1屬約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohnsonii)，最佳產(chǎn)酶條件為溫度30℃、培養(yǎng)基初始pH值為8.0
摘要：采用羅丹明B平板初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩法從含油脂豐富的土樣中篩選出產(chǎn)脂肪酶活性較高的菌株，并對(duì)活性最高的菌株TZ-1進(jìn)行16SrDNA鑒定和發(fā)酵產(chǎn)酶條件分析，發(fā)現(xiàn)TZ-1屬約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohnsonii)，最佳產(chǎn)酶條件為溫度30℃、培養(yǎng)基初始pH值為8.0、發(fā)酵時(shí)間48h，此時(shí)酶活性可達(dá)22.7U/mL;對(duì)TZ-1菌株所產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行酶催化特性分析發(fā)現(xiàn)，該脂肪酶屬中溫堿性脂肪酶，其最適作用溫度為50℃，最適作用pH為8.0，60℃下半衰期為3h，70℃下的半衰期約1.5h，pH值8～9時(shí)穩(wěn)定性良好。
關(guān)鍵詞：脂肪酶;菌株篩選鑒定;酶學(xué)性質(zhì);約氏不動(dòng)桿菌
脂肪酶(Triacylglycerolacylhydrolases，EC是一類可高效催化三酰甘油酯水解的酶類，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，可以催化酯化、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)和酸解等反應(yīng)，具有穩(wěn)定性好、催化專一性和底物多樣性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于油脂化工、食品工業(yè)、能源和環(huán)境等多種領(lǐng)域的工業(yè)生產(chǎn)中[1-2]。因動(dòng)植物來(lái)源的脂肪酶的種類和數(shù)量均較少，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用受限，微生物來(lái)源的脂肪酶研發(fā)與生產(chǎn)越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者和生產(chǎn)廠家的青睞[1-4]。
產(chǎn)脂肪酶的微生物種類很多，目前已發(fā)現(xiàn)有65個(gè)種屬的微生物可以產(chǎn)生脂肪酶[5]，其中細(xì)菌28個(gè)屬、酵母菌10個(gè)屬、放線菌4個(gè)屬、其他真菌23個(gè)屬[6]。因微生物具有種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異等特點(diǎn)，使得微生物產(chǎn)脂肪酶具有作用溫度范圍廣、作用值以及底物專一性更強(qiáng)，且微生物來(lái)源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，因而可人工控制大量積累目的酶，適合于進(jìn)行工業(yè)化大生產(chǎn)和獲取高純度樣品。早在20世紀(jì)60年代，假絲酵母、曲霉、根霉等發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酶已相繼在日本進(jìn)入商品化生產(chǎn)應(yīng)用[7]。我國(guó)也在20世紀(jì)60年代開始開展脂肪酶的研究開發(fā)，并于1969年將解脂假絲酵母(Candidalipolytica)發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酶制劑供應(yīng)市場(chǎng)，但到目前為止，只有解脂假絲酵母和擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)2種菌所產(chǎn)生的脂肪酶實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，與國(guó)外尚有一定差距[7-8]。因此篩選開發(fā)脂肪酶活力高、產(chǎn)量高、應(yīng)用成本低的新型脂肪酶產(chǎn)生菌具有重要的研究意義。
從江蘇省連云港東海縣某飯店附近下水道泥土中取樣，通過初篩、復(fù)篩等獲得一株高產(chǎn)脂肪酶的菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化，并對(duì)其脂肪酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步分析，以期為脂肪酶的更廣泛應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
土樣：江蘇省連云港東海縣某飯店下水道;氯化鈉、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、對(duì)硝基苯丁酯、對(duì)硝基苯酚、乙腈、橄欖油、羅丹明B、聚乙烯醇、其余試劑：分析純。
超凈工作臺(tái)：上海蘇凈凈化有限公司;恒溫培養(yǎng)箱：北京恒諾利興科技有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海南榮實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;冷凍離心機(jī)：Eppendorf中國(guó)有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1培養(yǎng)基及相關(guān)試劑配制LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10;初篩培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10，橄欖油乳化液10，瓊脂粉20;復(fù)篩培養(yǎng)基：初篩培養(yǎng)基中加入0.001%的羅丹明B;富集培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10，橄欖油乳化液5;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10，橄欖油乳化液10。
聚乙烯醇溶液：取20g聚乙烯醇，加蒸餾水800mL，加熱至全溶，冷卻后定容至1L，雙層紗布過濾后備用;橄欖油乳化液：按橄欖油與聚乙烯醇溶液以1:3的比例混合后，在300W超聲波下乳化5min;PBS緩沖液：稱取71.6gNa2HPO4·12H2O溶解后定容至1L(0.2mol/LNa2HPO4)，稱取31.2gNaH2PO4·2H2O溶解后定容至1L(0.2mol/LNaH2PO4)，取19mL0.2mol/L的NaH2PO4、81mL0.2mol/L的Na2HPO4混合后即得pH7.4、0.2mol/L的PBS緩沖液。
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1.2.2菌株的初篩稱取1g樣品溶于10mL帶有玻璃珠的無(wú)菌水中，震蕩充分溶解稀釋，無(wú)菌條件下取5mL的土壤稀釋液加入200mL富集培養(yǎng)液中，180r/min、28℃培養(yǎng)48h。取富集液進(jìn)行梯度稀釋、涂布于初篩培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)48h后，觀察平板上水解圈，將有水解圈的菌株進(jìn)行記錄保存。
1.2.3菌株的復(fù)篩挑取初篩平板上水解圈較大的20個(gè)單菌落分別接種于50mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180r/min培養(yǎng)48h。用打孔器在含0.001%羅丹明的復(fù)篩固體培養(yǎng)基平板上打孔，取1mL發(fā)酵液濾膜過濾，將濾液分別打到這些孔中，37℃培養(yǎng)48h，觀察熒光圈情況;剩余發(fā)酵液4℃、8000r/min離心10min，取上清液用硝基苯丁酸酯法測(cè)定脂肪酶活性。挑選有熒光圈且脂肪酶活性最高的菌株進(jìn)行菌種鑒定、菌株產(chǎn)酶條件分析和脂肪酶催化特性初步分析等試驗(yàn)。
1.2.4菌株鑒定挑取少量待測(cè)菌株于20mLLB液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min培養(yǎng)12h。取2μL菌液，用細(xì)菌16SrDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)為引物，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系為50μL(μL)：模板2，引物27F2，引物1492R2，10×PCRBuffer5，dNTPMix(2.5mmol/each)4，ddH2O34.5，TaqDNApolymerase(5U/L)0.5。
PCR反應(yīng)為：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán);72℃后延伸5min。
1.2.5粗酶液的制備與酶活性測(cè)定按照1%的接種量接種到50mL/250mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180r/min培養(yǎng)48h后，4℃、8000r/min離心10min，上清液即為脂肪酶粗酶液。
將2.78mLPBS緩沖溶液和0.2mL10mmol/L硝基苯丁酸酯組成的反應(yīng)體系37℃保溫15min后加入20μL脂肪酶粗酶液，立即混勻計(jì)時(shí)60s，加入3mL0.5mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)后，410nm條件下測(cè)定吸光度值[9]。以每分鐘產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。
1.2.6菌株產(chǎn)酶條件研究
1.2.6.1培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基于20、25、28、30、35℃溫度條件下，1%接種量、180r/min培養(yǎng)48h后測(cè)定其酶活性。
1.2.6.2培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，1%接種量、28℃、180r/min條件下培養(yǎng)48h后測(cè)定其酶活性。
1.2.6.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基于1%接種量、28℃、180r/min條件下分別培養(yǎng)12、24、36、48、60h后測(cè)定其酶活性。
1.2.7脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)分析
1.2.7.1溫度對(duì)脂肪酶催化和酶蛋白穩(wěn)定性的影響按照前述脂肪酶活性測(cè)定條件，將反應(yīng)體系分別置于20、30、40、50、60、70、80、90℃水浴鍋中反應(yīng)60s后測(cè)定其酶活性。
把粗酶液在30、40、50、60℃和70℃溫度條件下分別處理0、1、2、3、4h后測(cè)定各自剩余酶活性。
1.2.7.2pH值對(duì)脂肪酶催化和酶蛋白穩(wěn)定性的影響按照前述脂肪酶活性測(cè)定條件，將反應(yīng)體系中緩沖溶液替換為pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的緩沖溶液測(cè)定其脂肪酶活性。
將粗酶液在pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖溶液中于37℃水浴處理4h后，測(cè)定其剩余酶活性。
2結(jié)果與分析
2.1菌株篩選
土樣經(jīng)稀釋、富集培養(yǎng)后，根據(jù)水解圈的有無(wú)和大小，初篩出20株產(chǎn)脂肪酶的菌株。進(jìn)一步以羅丹明B復(fù)篩培養(yǎng)基熒光圈大小和發(fā)酵液脂肪酶活力大小為篩選條件，結(jié)果如圖1和表1所示。由表1可知，3號(hào)菌株發(fā)酵液脂肪酶活性最高，可達(dá)20.1U/mL，重新命名為TZ-1，并選擇該菌株進(jìn)行后續(xù)研究。
2.2菌株鑒定
以細(xì)菌16SrDNA通用引物27F和1492R為引物對(duì)TZ-1菌株進(jìn)行菌落PCR，電泳檢測(cè)(圖2)后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)TZ-1菌株的16SrDNA與不動(dòng)桿菌屬同源性最高。用MEGA-X軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果表明TZ-1菌株與Acinetobacterjohnsonii(NR_117624.1)和Acinetobacterjohnsonii(MK414979.1)進(jìn)化親緣關(guān)系最近。綜上所述，確定TZ-1為約氏不動(dòng)桿菌。
2.3菌株產(chǎn)酶條件研究
2.3.1培養(yǎng)溫度對(duì)TZ-1菌株產(chǎn)脂肪酶的影響溫度是影響微生物生長(zhǎng)代謝的一個(gè)重要因子，它可以同時(shí)通過影響生物體內(nèi)的眾多生化反應(yīng)和外界其他環(huán)境因子的變化而影響微生物的新陳代謝，從而影響微生物體內(nèi)多種生物酶的合成。試驗(yàn)中控制發(fā)酵培養(yǎng)溫度分別為20、25、28、30、35℃，分別測(cè)定其脂肪酶活性，結(jié)果如圖4所示。適當(dāng)提高發(fā)酵溫度有利于TZ-1菌株產(chǎn)生高活性的脂肪酶，其最適產(chǎn)酶溫度為30℃，此時(shí)脂肪酶活性可達(dá)18.4U/mL。
2.3.2培養(yǎng)基初始pH值對(duì)TZ-1菌株產(chǎn)酶的影響
將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，發(fā)酵后測(cè)定其脂肪酶活性，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，TZ-1菌株發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的活性隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在pH值為8.0時(shí)，脂肪酶活性最高，可達(dá)19.9U/mL。
2.3.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為12、24、36、48、60h，然后測(cè)定其發(fā)酵液中脂肪酶的活性，結(jié)果如圖6所示。脂肪酶活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，48h時(shí)達(dá)到最高值20.1U/mL。
2.3.4驗(yàn)證試驗(yàn)綜合上述產(chǎn)酶條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)基初始pH8.0、接種量2%、培養(yǎng)時(shí)間48h，此時(shí)TZ-1菌株所產(chǎn)脂肪酶酶活為22.7U/mL，高于試驗(yàn)中其他發(fā)酵條件下所產(chǎn)脂肪酶的酶活。
2.4脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)分析
2.4.1溫度對(duì)脂肪酶催化活性和酶蛋白熱穩(wěn)定性的影響在20～90℃溫度內(nèi)，對(duì)TZ-1發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶酶促反應(yīng)活性受溫度的影響狀況進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖7所示。在20～50℃溫度內(nèi)，隨著酶促反應(yīng)溫度的升高，目的脂肪酶反應(yīng)活性逐步增加，50℃時(shí)達(dá)到最高，為21.8U/mL;之后，隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，高溫導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)變性，從而使得目的脂肪酶反應(yīng)活性迅速降低;至90℃時(shí)，目的脂肪酶反應(yīng)活性低至4.5U/mL。綜上所述，TZ-1菌株發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酶屬于中溫脂肪酶。
進(jìn)一步研究該脂肪酶在各溫度下的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在30、40、50℃的溫度下，2h內(nèi)酶活較為穩(wěn)定，均可保持初始酶活80%以上，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，殘余酶活逐漸降低，4h后降為初始酶活的60%～70%;60℃時(shí)，脂肪酶熱穩(wěn)定性有較大幅度降低，2h內(nèi)剩余酶活僅為初始酶活的62%，4h后降為初始酶活的40%，其半衰期約為3h;而在70℃條件下，目的脂肪酶相當(dāng)不穩(wěn)定，約1.5h即達(dá)到該脂肪酶的半衰期，4h后剩余酶活僅為初始酶活12%(圖8)。
2.4.2pH值對(duì)脂肪酶催化活性和酶蛋白酸堿穩(wěn)定性的影響TZ-1產(chǎn)脂肪酶酶促反應(yīng)最適pH值試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，隨著pH值增加，TZ-1產(chǎn)脂肪酶酶促反應(yīng)酶活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，pH值6時(shí)脂肪酶活性較小(約9.1U/mL)，pH6～7的斜率明顯要低于pH7～8的斜率，說(shuō)明當(dāng)反應(yīng)體系由弱酸性變?yōu)槿鯄A性后，脂肪酶催化活性快速增加，在pH8時(shí)活性達(dá)到最大值，為20.8U/mL;之后，隨著pH值繼續(xù)增大，酶催化活性逐漸降低，但在pH8～11降低趨勢(shì)比較緩慢，說(shuō)明TZ-1菌株所產(chǎn)脂肪酶屬于堿性脂肪酶，酸性條件不利于該脂肪酶作用(圖9)。
脂肪酶pH值穩(wěn)定性試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，TZ-1產(chǎn)脂肪酶在pH6～7的緩沖溶液中處理4h后，酶活性下降較為明顯，剩余酶活僅為初始酶活的67%～70%;在pH8～9時(shí)，脂肪酶活性較為穩(wěn)定，剩余酶活均在80%以上;隨著處理pH值繼續(xù)增加，目的脂肪酶活性又有較為明顯的下降(圖10)。綜上所述，TZ-1所產(chǎn)脂肪酶的酶活性在pH8～9范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。
3討論
目前，假單胞菌、鏈霉菌、克雷伯氏菌、伯克霍爾德氏菌、芽孢桿菌和發(fā)光桿菌等細(xì)菌已見報(bào)道被用于脂肪酶生產(chǎn)，近年來(lái)關(guān)于不動(dòng)桿菌產(chǎn)脂肪酶的研究報(bào)道逐漸增多[10-14]。不動(dòng)桿菌是嚴(yán)格好氧細(xì)菌，普遍存在于土壤中[15]，其所產(chǎn)生的脂肪酶多為中溫酶、最適作用溫度40～60℃、熱穩(wěn)定性較好、最適作用pH7.0～10.0、耐堿性較好[10,16]。篩選得到的約氏不動(dòng)桿菌TZ-1所產(chǎn)的脂肪酶最適溫度50℃、在30～50℃溫度內(nèi)熱穩(wěn)定性好、最適pH值為8.0、在pH8～9內(nèi)可較長(zhǎng)時(shí)間以較高活性穩(wěn)定存在，符合有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，且TZ-1菌株所產(chǎn)的脂肪酶在60～70℃仍有較好的熱穩(wěn)定性，表明其在環(huán)境治理、洗滌制品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
