發(fā)布時(shí)間：2020-04-17所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:為評(píng)價(jià)干酪乳桿菌生物合成胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)抗氧化活性，本文分離純化高產(chǎn)胞外多糖的三株副干酪乳桿菌(3號(hào)、5號(hào)和7號(hào))的胞外多糖，并對(duì)其DPPH、OH和O-2清除率分別進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。通過分析EPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷293T細(xì)
摘要:為評(píng)價(jià)干酪乳桿菌生物合成胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)抗氧化活性，本文分離純化高產(chǎn)胞外多糖的三株副干酪乳桿菌(3號(hào)、5號(hào)和7號(hào))的胞外多糖，并對(duì)其DPPH·、·OH和O-2清除率分別進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。通過分析EPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷293T細(xì)胞的保護(hù)作用，評(píng)價(jià)其胞內(nèi)抗氧化活性。結(jié)果表明，當(dāng)EPS濃度為400μg/mL時(shí)，其DPPH·、·OH和O-2的清除率最高，分別為8.87%(5號(hào))、88.94%(7號(hào))和34.55%(7號(hào))，其中對(duì)·OH清除能力高于抗壞血酸(65.87%)，且三株菌株之間沒有明顯差異。3號(hào)副干酪乳桿菌所產(chǎn)EPS顯著提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)活性并抑制了丙二醛(MDA)的生成(P<0.05)，且與多糖濃度呈正相關(guān)。因此，3株副干酪乳桿菌胞外多糖具有良好的抗氧化活性，作為天然抗氧化劑具有良好的應(yīng)用潛力。
關(guān)鍵詞:副干酪乳桿菌，胞外多糖，抗氧化活性
乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過程中分泌到細(xì)胞外的一種糖類化合物[1]，是乳酸菌在長(zhǎng)進(jìn)化過程中適應(yīng)環(huán)境的產(chǎn)物，不僅可以保護(hù)菌體而且因其具有調(diào)節(jié)皮膚免疫力、抗腫瘤、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等作用，在諸如化妝品、制藥、食品等生物技術(shù)方面得以應(yīng)用[2-6]。
近年來，乳酸菌胞外多糖的抗氧化性也是研究的熱點(diǎn)[7-10]，由氧自由基引起的氧化應(yīng)激(Oxidativestress)是各種退行性疾病的主要發(fā)病因素，如癌癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥[11]。在正常情況下，機(jī)體中的活性氧在細(xì)胞的生命活動(dòng)中是積極存在的。機(jī)體中存在著一種自我平衡(Homeostasis)的過程，通過自身的抗氧化防護(hù)和修復(fù)機(jī)制將體內(nèi)的活性氧維持在平衡狀態(tài)，但是當(dāng)機(jī)體處于疾病或者感染等不利的環(huán)境條件或者遭受外源自由基入侵的情況下，自由基與抗氧化劑體系之間的平衡被打破，自由基累積就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激[12]。研究表明，副干酪乳桿菌VL8經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化后胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)263.74mg/L，并發(fā)其所產(chǎn)胞外多糖有較好的抑制脂質(zhì)過氧化和·OH清除能力[13]。其他乳酸菌如植物乳桿菌C88胞外多糖LPC-1對(duì)羥基自由基具有良好的清除能力[14]，嗜酸乳桿菌胞外多糖也具有清除自由基、螯合金屬離子、抑制脂質(zhì)氧化的作用[15]，其中保加利亞乳桿菌SRFM-1胞外多糖可以對(duì)O-2、·OH、DPPH·自由基等顯示出強(qiáng)烈的清除活性[16]。這些研究證明了乳酸菌胞外多糖在抗氧化方面的巨大潛力，使得乳酸菌胞外多糖作為一種具有強(qiáng)抗氧化活性的、有效的、無毒的和有前途的抗氧化劑，是藥物開發(fā)的重要候選。
本研究從四川傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離得到的三株高產(chǎn)胞外多糖的副干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)液中提取其生物合成的胞外多糖，對(duì)其體內(nèi)外抗氧化特性進(jìn)行研究，以期為擴(kuò)大乳酸菌的綜合利用，以及乳酸菌胞外多糖在食品體系中作為一種具有抗氧化性質(zhì)的新型添加劑提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
副干酪乳桿菌3號(hào)、5號(hào)和7號(hào)三株菌株均來源于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院應(yīng)用微生物組從四川傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離獲得，并在-80℃下含20%甘油的MRS培養(yǎng)基中儲(chǔ)存;蛋白胨、牛肉膏、酵母粉OXOIDLTD.;葡萄糖、無水乙醇西隴化工股份有限公司;三水合磷酸氫二鉀廣東光華科技股份有限公司;乙酸鈉、七水硫酸鎂、四水硫酸錳、檸檬酸鉀、碳酸氫鈉、苯酚、抗壞血酸、過氧化氫、硫酸亞鐵天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;Tween-80、DPPH自由基、亮綠、鄰苯三酚Solarbio公司;三氯乙酸天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;乙二胺四乙酸生工生物工程(上海)有限公司;硫酸重慶川東化工(集團(tuán))有限公司;杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基(DMEM)德國Invitrogen公司;MDA、SOD、T-AOC測(cè)定試劑盒上海世鋒生物科技有限公司。
相關(guān)期刊推薦：《食品工業(yè)科技》雜志創(chuàng)刊于1979年，國家輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)(原國家輕工業(yè)部)主管，北京市食品工業(yè)研究所主辦的綜合性科技期刊。主要探討：研究與探討，工藝技術(shù)，包裝與機(jī)械，食品添加劑，食品安全，儲(chǔ)運(yùn)保鮮，分析檢測(cè)，綜述等，以新技術(shù)及實(shí)用技術(shù)為核心，啟發(fā)企業(yè)技術(shù)人員思路，開發(fā)新產(chǎn)品。面向全國大中型食品企業(yè)，政府管理機(jī)構(gòu)，食品及相關(guān)專業(yè)大專院校，綜合性科技期刊覆蓋食品各分支行業(yè)，不論對(duì)企業(yè)決策者，還是研發(fā)人員都能提供有益的幫助。
SI-234天平德國DenverInstrument公司;AutoclaveSX-500滅菌鍋TOMY公司;GRX-9123A烘箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;GL-3250A磁力攪拌器ASONE公司;GHP-9160培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;YC-300L冰箱中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司;3-18K124178離心機(jī)SIGMA公司;透析袋(1000)美國聯(lián)合碳化公司;FD5-12真空冷凍干燥機(jī)SIM公司;BiochromUltrospec2100proUV分光光度計(jì)美國柏楉有限公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1培養(yǎng)基配制MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，三水合磷酸二氫鉀2g/L，乙酸鈉5g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，四水硫酸錳0.05g/L，檸檬酸三銨2g/L，Tween801mL/L。
MRS改良培養(yǎng)基[17]:葡萄糖20g/L，酵母粉30g/L，三水合磷酸二氫鉀2g/L，乙酸鈉5g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，四水硫酸錳0.05g/L，檸檬酸三銨2g/L，Tween801mL/L。
1.2.2菌株的活化與培養(yǎng)將三株副干酪乳桿菌從-80℃取出后按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種至含有5mLMRS基本培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)12h。傳代培養(yǎng)2次后再按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的含有500mLMRS改良培養(yǎng)基的錐形瓶中37℃培養(yǎng)24h。
1.2.3胞外多糖分離純化將細(xì)菌培養(yǎng)液于4℃、10000×g離心15min，除去細(xì)胞，在上清中加三氯乙酸(TCA)至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，并在室溫下震蕩搖勻，靜置30min，10000×g離心15min去除沉淀蛋白;離心后的上清中加三倍體積的預(yù)冷無水乙醇沉淀，-20℃過夜;4℃、12000×g離心30min收集沉淀;將沉淀用ddH2O溶解，轉(zhuǎn)移到經(jīng)過前處理(將透析袋根據(jù)自己的需要剪成適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，一般為10～20cm的小段;在大體積的質(zhì)量體積比為2%碳酸氫鈉和1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA，pH8)的溶液中，將透析袋煮沸10min;用蒸餾水徹底清洗透析袋;再用1mmol/L的EDTA(pH8)溶液將透析袋煮沸10min;冷卻后存放于4℃冰箱中)的透析袋中透析2d，期間每8h換水一次;收集透析液后真空冷凍干燥[18]。
1.2.4總糖量測(cè)定將冷凍干燥后的三株副干酪乳桿菌胞外多糖用ddH2O溶解，利用苯酚-硫酸法[19]測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程:y=14.929x+0.007，R2=0.9996，曲線擬合良好，并通過回歸方程計(jì)算副干酪乳桿菌的胞外多糖產(chǎn)量。
2結(jié)果與分析
2.1總糖量測(cè)定結(jié)果
本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定所分離的胞外多糖產(chǎn)量，3號(hào)、5號(hào)、7號(hào)菌株的產(chǎn)量分別達(dá)(205.863±4.306)、(210.775±6.331)、(233.550±4.306)mg/L。李向菲等[22]根據(jù)產(chǎn)量將產(chǎn)胞外多糖乳酸菌分為高產(chǎn)(產(chǎn)量≥180mg/L)、中產(chǎn)(180>產(chǎn)量≥120mg/L)和低產(chǎn)(產(chǎn)量<120mg/L)胞外多糖菌株。本研究這三株菌株胞外多糖產(chǎn)量都高于180mg/L，根據(jù)劃分標(biāo)準(zhǔn)，這三株副干酪乳桿菌均為胞外多糖高產(chǎn)菌株。
2.2DPPH·清除活性分析
抗壞血酸以及副干酪乳桿菌生物合成胞外多糖清除DPPH活性如圖1所示。3株副干酪乳桿菌生物合成胞外多糖均具有一定清除DPPH·的能力，且對(duì)清除DPPH·的能力均表現(xiàn)出濃度依賴的特征，對(duì)DPPH·清除率隨胞外多糖的濃度100～400μg/mL逐漸增大，當(dāng)胞外多糖濃度為400μg/mL時(shí)，3號(hào)、5號(hào)、7號(hào)菌株胞外多糖對(duì)DPPH·清除率分別為6.55%、8.87%、8.80%(圖1B)，但均低于抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率(圖1A)。Zhang等[14]對(duì)植物乳桿菌C88胞外多糖抗氧化性分析得到類似的結(jié)果，他們結(jié)果顯示胞外多糖對(duì)DPPH·清除活性隨其濃度增加而增加，當(dāng)胞外多糖濃度達(dá)1.0mg/mL時(shí)活性最大，進(jìn)一步增加也不會(huì)顯著影響活性，當(dāng)濃度為4.0mg/mL時(shí)，其胞外多糖和抗壞血酸分別顯示出DPPH自由基清除活性為52.23%和88.60%;而張玉龍等[23]篩選出的8株產(chǎn)胞外多糖乳酸菌中，七株乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖均比抗壞血酸的DPPH·清除能力強(qiáng)，并且其胞外多糖的DPPH·清除能力，最高可達(dá)11.93%±0.01%，是抗壞血酸的2倍。
2.3·OH清除活性分析
在本研究中，·OH來源于Fenton反應(yīng)(Fe2++H2O2=Fe3++OH-+HO·)，以亮綠作為顯色劑。胞外多糖對(duì)·OH的清除活性如圖2所示。隨著胞外多糖的濃度增加，清除率呈上升趨勢(shì)，并且具有明顯的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)胞外多糖濃度達(dá)400μg/mL時(shí)，3號(hào)、5號(hào)、7號(hào)3株副干酪乳桿菌胞外多糖對(duì)自由基清除率分別為86.57%、82.59%、88.94%，均高于抗壞血酸的清除率(65.87%)，這表明3株副干酪乳桿菌胞外多糖都具有強(qiáng)的·OH清除能力。Guo等[24]的研究結(jié)果也得到相同的結(jié)果，胞外多糖羥基自由基清除活性以濃度依賴的方式增加。另有研究表明，副干酪乳桿菌VL8所產(chǎn)胞外多糖在濃度于200μg/mL時(shí)其胞外多糖的·OH清除率與抗壞血酸就已經(jīng)基本持平(41%)，并且隨著EPS濃度的增加其羥基自由基清除率也有所增長(zhǎng)[13]。這體現(xiàn)出本研究所分離的3株副干酪乳桿菌EPS在·OH清除方面是具有一定潛力。
2.4O-2·清除活性分析
根據(jù)圖3結(jié)果來看，3株副干酪乳桿菌生物合成的胞外多糖均具有清除超氧陰離子自由基的能力。隨著胞外多糖的濃度增加，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨之上升，在胞外多糖濃為達(dá)400μg/mL時(shí)，3號(hào)、5號(hào)、7號(hào)菌株生物合成的胞外多糖對(duì)超O-2·的清除率分別為24.86%、34.55%、19.44%，均低于抗壞血酸對(duì)·OH清除率(81.35%)，說明這三株副干酪乳桿菌所產(chǎn)胞外多糖對(duì)O-2具有一定的清除能力。
2.5胞外多糖緩解293T細(xì)胞氧化損傷能力評(píng)價(jià)
2.5.1丙二醛(MDA)含量丙二醛(MDA)是自由基攻擊膜不飽和脂肪酸的產(chǎn)物可以與蛋白質(zhì)的游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[25]，MDA含量越高說明細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)的3號(hào)副干酪乳桿菌胞外多糖作用H2O2誘導(dǎo)的293T細(xì)胞的MDA含量的結(jié)果如圖4所示。將對(duì)照組293T細(xì)胞內(nèi)MDA水平與模型組293T細(xì)胞(內(nèi)MDA水平進(jìn)行比較，在胞外多糖濃度100～400μg/mL時(shí)，MDA的水平均有顯著的降低(P<0.05)。隨著胞外多糖濃度的升高，MDA水平呈逐步降低的趨勢(shì)，高濃度(400μg/mL)胞外多糖處理導(dǎo)致MDA水平最低。MDA水平的逐漸降低，表明胞外多糖在一定程度上抑制了膜脂質(zhì)過氧化，保護(hù)了細(xì)胞的脂質(zhì)膜，阻斷了外界活性氧的侵入。有研究顯示植物乳桿菌的胞外多糖能夠抑制Caco-2細(xì)胞內(nèi)MDA的形成，用胞外多糖處理后的胞內(nèi)MDA水平顯著降低(P<0.05)，并且具有劑量效應(yīng)[14]，這與本研究結(jié)果一致。
2.5.2超氧化物歧化酶(SOD)活力超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能專一地清除體內(nèi)有害的自由基，以解除自由基氧化體內(nèi)的某些組成成分而造成的機(jī)體損害，其活性的高低可間接反映組織中超氧自由基的含量和細(xì)胞受損程度[21]。胞外多糖作用于H2O2誘導(dǎo)的293T損傷細(xì)胞的SOD活性的結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組相比模型組SOD活性顯著降低，經(jīng)過胞外多糖處理后SOD活性有所增加，并且隨著胞外多糖濃度的升高SOD活性逐步增大。同類研究中，Zhang[14]等在對(duì)植物乳桿菌C88胞外多糖抗氧化性
注:小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05);圖5、圖6同。的進(jìn)一步研究顯示，將胞外多糖預(yù)處理24h即可以恢復(fù)H2O2處理的Caco-2細(xì)胞的SOD活性，與氧化損傷模型細(xì)胞相比，高劑量的胞外多糖(100和200μg/mL)能顯著提高SOD水平。白麗娟[26]利用瑞士乳桿菌SMN2-1的主要多糖組分EPS-S1處理D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型，也發(fā)現(xiàn)當(dāng)胞外多糖為100及200mg/kg時(shí)能夠極顯著恢復(fù)肝臟以及腦組織中SOD活性(P<0.01)。這也表明了乳酸菌胞外多糖在抗氧化方面所具有的潛力。本實(shí)驗(yàn)所用的胞外多糖能夠清除H2O2造成的自由基從而恢復(fù)SOD活性。
2.5.3總抗氧化(T-AOC)能力如圖6所示，將293T細(xì)胞用H2O2誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞的總抗氧化能力顯著降低(P<0.05)，當(dāng)用胞外多糖的處理之后，使得損傷細(xì)胞的總抗氧化能力得以逐步恢復(fù)，這表明胞外多糖對(duì)能夠緩解細(xì)胞的氧化損傷。在胞外多糖濃度為100、200、300和400μg/mL時(shí)，對(duì)照組、模型組以及各多糖處理組的總抗氧化活性分別是1.480、0.575、1.069、1.480、1.932和2.056U/mL。經(jīng)過不同濃度的EPS孵育后T-AOC水平顯著提高(P<0.05)。從總抗氧化水平來看，高濃度(≥300μg/mL)的EPS可以提高細(xì)胞的總抗氧化能力，陳佩等[27]研究了干酪乳桿菌對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化功能的影響，結(jié)果谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSHPx)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活力分別提高了80%、30%和124%(P<0.05)。
總之，根據(jù)本研究中各氧化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，我們認(rèn)為可能是由于胞外多糖清除了部分自由基，并且能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)起到輔助甚至促進(jìn)的作用，保證其正常的運(yùn)行，抵御H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，使細(xì)胞得以修復(fù)。
3結(jié)論
作為一種天然的抗氧化物質(zhì)，乳酸菌胞外多糖具有巨大的開發(fā)潛力，本研究所探討的3株副干酪乳桿菌生物合成的胞外多糖在體內(nèi)外均有一定的抗氧化能力。體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，胞外多糖對(duì)羥基自由基清除能力較好。而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌產(chǎn)胞外多糖作用于H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的293T細(xì)胞，能夠顯著的提高SOD活性、總抗氧化能力并抑制丙二醛(MDA)的生成(P<0.05)。總之，這3株株副干酪乳桿菌胞外多糖具有良好的抗氧化性，作為食品添加劑有較好的運(yùn)用潛力，如何增強(qiáng)其抗氧化性能將是之后的研究方向。
