不同測定方法探討重金屬對微生物毒性的影響

發布時間：2020-02-28所屬分類：農業論文瀏覽：1273次

摘 要： 摘要：微生物是污水處理工藝中污染物的重要分解者，重金屬對活性污泥微生物具有一定毒性。為了研究和比較重金屬對活性污泥微生物的毒性影響，采用發光細菌毒性、活性污泥脫氫酶毒性、硝化抑制毒性3種方法測定4種重金屬(Hg、Cd、Zn、Pb)對活性污泥微生物的毒

　　摘要：微生物是污水處理工藝中污染物的重要分解者，重金屬對活性污泥微生物具有一定毒性。為了研究和比較重金屬對活性污泥微生物的毒性影響，采用發光細菌毒性、活性污泥脫氫酶毒性、硝化抑制毒性3種方法測定4種重金屬(Hg、Cd、Zn、Pb)對活性污泥微生物的毒性，并對測定結果進行了比較。結果表明，4種重金屬均可降低污泥系統CODCr的去除率，其中，Cd和Hg對CODCr去除率的影響最明顯(43.2%-92.3%和52.4%-92.5%)，而Pb和Zn對活性污泥CODCr去除率的影響較小。發光細菌毒性測定方法的靈敏度最高(達50%以上)，測得的重金屬半數有效濃度(EC50)最低(Hg9.6mg·L−1，Cd0.3mg·L−1，Zn3.6mg·L−1，Pb13.9mg·L−1)，4種重金屬對發光細菌發光強度的抑制程度表現為Hg>Cd>Zn>Pb，發光細菌的發光強度抑制率與重金屬的對數濃度呈極顯著的線性相關關系(P<0.01)，發光細菌發光強度隨重金屬對數濃度的增大而減小。活性污泥脫氫酶毒性和硝化抑制毒性的測定結果與發光細菌毒性測定結果相比，靈敏度相對較低，測得的重金屬EC50相對較高，活性污泥脫氫酶活性的抑制程度大小順序為Cd>Hg>Zn>Pb，與測得的活性污泥硝化速率抑制程度大小順序一致，但二者測得的EC50有所差別。4種重金屬與活性污泥脫氫酶活性的Logistic回歸方程均達到極顯著水平(P<0.01)，活性污泥SVI值隨重金屬濃度的增加而升高，當重金屬濃度較低時，其對活性污泥SVI的影響并不大。為了更準確地判定重金屬對活性污泥微生物的毒性影響，應取不同的重金屬毒性終點指示指標進行毒性組實驗，而不能以發光細菌毒性的單一測定結果作為評判依據。

　　關鍵詞：重金屬;發光細菌;脫氫酶;硝化抑制

　　隨著工業化進程的加快，各大城市紛紛建立工業區集中水處理設施，減輕了城市污水處理系統及地表水的負擔(王凱軍等，2001;余杰等，2007;Vachovápetal.，2017)。然而，受到城市規劃的歷史影響，有時工業廢水會流入城市生活污水處理系統中，容易對其中的微生物造成影響，并且降低活性污泥的處理效率。在城市廢水的集中生化處理過程中，活性污泥法由于低價高效而被普遍使用。而活性污泥法中，微生物是有機污染物的主要分解者，當重金屬存在時，會對活性污泥處理系統造成很大影響(趙慶良等，2006;竺建榮等，1999;Goronszyetal.，1996)。活性污泥法被廣泛應用于城市污水和工業廢水的集中生化處理中，其本質是污泥微生物通過氧化水中的有機物質，產生維持自身生存和增長的能量，同時達到降解有機物、凈化水質的目的(竺建榮等，1999;Rodrãguezetal.，2018)，這也是防止工業污水進入城市污水處理系統的最主要手段之一。因此，活性污泥法被廣泛應用于城市廢水的集中生化處理過程中。在活性污泥生物處理過程中，微生物生命活動需要大量的營養物質，其中就包括作為酶的活性劑與活化劑的微量重金屬(劉銳等，2001;李娟英等，2009;Jacobetal.，2018)。

　　微生物是污水處理工藝中污染物的重要分解者，重金屬對活性污泥微生物的毒性研究也一直備受關注(李娟英等，2009;劉新春等，2005)，重金屬對微生物的毒害作用可導致處理系統的微生物種群結構發生改變，影響污水處理效果。近年來不少學者開展了重金屬毒性帶來的污水處理影響機理，并提出了相應的檢測方法，探究重金屬對微生物結構和活動產生的作用(蔣成愛等，2001;呂錫武，2001)，但是所提出的觀點不盡一致，研究視角也不盡相同。由于測定方法不統一，且每種方法都有其優缺點和適用條件，導致很多的研究結論差別很大，有的甚至相互矛盾(謝冰等，2003;Weietal.，2010;Miśkowiecetal.，2015;Yangetal.，2018)。從目前的研究成果來看，在重金屬對生態環境的毒性影響方面最常用的毒性測定方法是生物試驗法，即通過生物體或細胞的存活時間和繁殖量來判斷毒性的大小，從而獲得重金屬毒性的相關信息。由于重金屬對活性污泥微生物的毒性與化學反應速率和微生物生長速率有關，單一采用生化法或生物法測得的結果無法為活性污泥工藝運行提供科學指導。鑒于此，筆者以活性污泥為受試對象，研究了4種常見重金屬對污泥活性及微生物的影響，嘗試運用不同測定方法來研究重金屬對活性污泥微生物的毒性，以期為污水生物處理工藝運行和設計管理提供理論依據。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料

　　藥劑：ZnCl2、PbCl2、CdCl2、HgCl2、CuSO4、Pb(NO3)2、Hg(NO3)2、氯化三苯基四氮唑(TTC)標準溶液，均為分析純。

　　細菌：502發光細菌凍干粉，來源于福建省農科院。

　　活性污泥：活性污泥脫氫酶毒性實驗和硝化抑制毒性實驗中所用活性污泥分別取自城市污水處理廠A/O工藝的A段和O段(具有硝化功能的活性污泥)。該污水處理廠接納的污水中，90%是生活污水，10%為工業污水，主要包括食品加工廠、物流沖洗污水和餐飲污水，揮發性懸浮固體(VSS)濃度與總固體懸浮物(SS)濃度之比約為0.71，污泥沉降指數(SVI)為78-109，pH為7.8。

　　模擬廢水：采用葡萄糖、奶粉、磷酸二氫鉀、氯化銨配制，4種物質的比例為20꞉5꞉5꞉1，CODCr為600mg·L−1左右，NH4+-N濃度為50mg·L−1，4℃保存。

　　重金屬溶液：配制重金屬濃度為1.0g·L−1的溶液，備用。

　　主要儀器：ET-99718微電腦化學需氧量測定儀;YSI-5000DO測定儀;島津UV-2450紫外可見分光光度計。

　　1.2試驗方法

　　1.2.1一次暴露

　　試驗取離心(3000r·min−1，20℃)后的活性污泥30g加入1500mL曝氣反應器中，然后分別加入含不同濃度重金屬的模擬廢水1000mL，充氧曝氣24h，反應后采用MLSS型懸浮物(污泥)濃度計(德國，MLSS10AC+MLSS-S0C10)測定該活性污泥系統的污泥沉降指數(SV30)、活性污泥中懸浮固體含量(MLSS)，并計算污泥體積指數(SVI)：SVI=SV30/MLSS;使用顯微鏡觀察污泥中的生物相;靜置沉淀60min后取上清液測CODCr值;最后測定反應后活性污泥的脫氫酶活性、活性污泥的耗氧速率(活性污泥耗氧速率測定儀，美國，AER-208)，所有試驗維持曝氣量不變。

　　1.2.2中毒污泥二次培養試驗

　　采用二次培養試驗檢驗重金屬中毒活性污泥經短時間培養后的活性恢復情況。從曝氣反應器中取出活性污泥混合液，離心后棄上清液。并使用蒸餾水洗滌3次，加入不含重金屬的模擬廢水，曝氣反應24h，然后測定廢水CODCr值及活性污泥的耗氧速率。

　　CODCr采用快速COD測定儀檢測;耗氧速率采用YSI5000DO測定儀測定;脫氫酶活性采用島津UV-2450紫外可見分光光度計測定，其作用原理為：無色的2,3,5-三苯基四氮唑氯化物在脫氫酶作用下可轉化為紅色的三苯甲基(TF)，因此，通過檢測TF的產生量可間接評價污泥脫氫酶的活性。

　　1.2.3活性污泥脫氫酶毒性測定

　　(1)TTC標準曲線繪制(李光偉等，2007)

　　分別取TTC質量濃度為0、20、40、60、80、100、120、140μg·mL−1的標準溶液各1.0mL，置于10mL離心管中，再加入2mL三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖溶液、1mL質量分數為10%的Na2S溶液和1mL蒸餾水;將離心管置于37℃恒溫水浴中振蕩30min，加入0.5mL甲醛，再加入5mL質量分數為80%的丙酮，在37℃恒溫水浴振蕩10min，萃取完畢后，于4000r·min−1離心5min，取上清液于分光光度計485nm處測定吸光度;以TTC質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，通過標準曲線計算TTC還原產物三苯甲基(TF)的生成量。

　　(2)活性污泥脫氫酶毒性試驗

　　將活性污泥先曝氣24h，以保證所有外源基質被耗盡，然后取適量污泥混合液，用蒸餾水洗滌2次后加水稀釋，將MLSS控制在2000mg·L−1左右，從中取一系列體積為50mL的污泥混合液樣品，并測定樣品的初始活性污泥脫氫酶活性;為消除pH對實驗結果的影響，用磷酸鹽緩沖溶液將樣品的pH調節為7.2;根據樣品的重金屬濃度梯度，向樣品中加入不同量的重金屬化合物，并保持樣品總體積不變;將樣品振蕩2h后，測定抑制后的活性污泥脫氫酶活性，同一污泥混合液樣品平行測定3次。

　　相關期刊推薦：《生態環境學報》Ecology and Environmental Sciences(月刊)曾用刊名：土壤與環境;生態環境;熱帶亞熱帶土壤科學，1992年創刊，主要刊登國內外生態學和環境科學具有明顯創新性和重要意義的原創性研究論文、重大調查研究報告，以及對這兩個學科的重大前沿問題有獨到見解和理論建樹的綜述文章和觀點類文章。適合從事生態學、環境科學、資源保護、土壤學、大氣科學、水科學、地理學、地質學、地球科學、農業科學、林學、醫學、社會科學、經濟科學等領域的科技人員、學者、教師、學生、各級管理者和環境愛好者閱讀。

　　取1mL污泥混合液樣品置于10mL離心管中，依次加入2mLTris-HCl緩沖溶液、0.5mL質量濃度為0.1mol·L−1的葡萄糖溶液和0.5mL質量分數為0.4%的TTC溶液;并迅速將制備好的樣品放置于37℃恒溫水浴中振蕩2h，然后加入0.5mL甲醛終止反應;于4000r·min−1離心5min后去除上清液，加入5mL萃取劑，于37℃恒溫水浴振蕩10min;萃取完畢后再于4000r·min−1離心5min，取上清液于分光光度計485nm處測定吸光度;取經離心的沉淀污泥在105℃烘干2h測其質量。

　　2結果與分析

　　2.1重金屬對污泥活性的影響

　　2.1.1重金屬對活性污泥CODCr去除率的影響

　　由圖1可知，在不同濃度條件下，4種重金屬均可使污泥系統的CODCr去除率下降。其中，Cd和Hg對CODCr去除率的影響最明顯(其變化幅度較大)，這2種金屬濃度為50mg·L−1時，對系統的處理能力產生很大影響，CODCr去除率均降至50%以下;而Zn和Pb對活性污泥CODCr去除率的影響較小。

　　2.1.2重金屬對活性污泥微生物脫氫酶活性的影響

　　重金屬濃度與活性污泥脫氫酶活性的Logistic回歸方程擬合參數如表1所示，由表可知，4種重金屬與活性污泥脫氫酶活性的Logistic回歸方程均達到極顯著水平(P<0.01)，就k值而言，Cd和Pb實測值顯著高于Hg和Zn(P<0.05);EC50大致表現為Pb>Zn>Cd>Hg，其中不同重金屬EC50差異均顯著(P<0.05);就b值而言，Hg顯著高于其他重金屬(P<0.05)，而其他3種重金屬差異不顯著(P>0.05)。

　　不同重金屬對TF生成量的影響如圖2所示，由圖可知，不同重金屬對TF生成量的影響較大，4種重金屬對活性污泥脫氫酶活性的抑制程度均隨著重金屬濃度的增加而降低，表現為Cd>Hg>Zn>Pb。此抑制程度大小順序與發光細菌的發光強度抑制率大小順序有所不同，Cd對活性污泥脫氫酶活性的抑制作用大于Hg，Pb和Zn的EC50測定結果稍微偏大。

　　2.1.3重金屬對系統SVI的影響

　　由圖3可知，4種重金屬對活性污泥SVI值隨重金屬濃度的增加而升高，較低濃度重金屬對活性污泥SVI值影響并不大，相同濃度下重金屬對系統SVI的影響大致表現為Hg>Cd>Pb>Zn。

　　2.2重金屬對污泥微生物毒性的影響

　　2.2.1重金屬對發光細菌的毒性的影響

　　測定了Hg、Cd、Zn和Pb4種重金屬對發光細菌的毒性，結果見圖4，由圖可知，發光細菌的發光強度抑制率與重金屬的對數呈極顯著的線性相關關系(P<0.01)，即發光細菌發光強度隨重金屬對數濃度的增大而呈下降趨勢。因此，在給定重金屬濃度的情況下，可以根據劑量-效應回歸方程計算發光細菌的發光強度抑制率。

　　通過上述發光細菌的發光強度抑制率與重金屬的對數濃度的線性相關分析，將重金屬對數濃度(lgx)和發光細菌發光強度抑制率(i)進行回歸分析，得到劑量-效應回歸方程和重金屬的EC50(見表2)。由表可知，4種重金屬對發光細菌發光強度的抑制程度表現為Hg>Cd>Zn>Pb。

　　2.2.2重金屬對硝化抑制的毒性

　　重金屬濃度對活性污泥硝化速率的影響見圖5，對實驗結果進行Monod方程擬合，由圖5可知，4種重金屬對活性污泥硝化速率的抑制程度表現為Cd>Hg>Zn>Pb，與重金屬對活性污泥脫氫酶活性的抑制程度大小順序一致。

　　2.2.3重金屬毒性測定結果的比較

　　利用不同重金屬毒性測定方法得到的重金屬毒性結果不盡相同。由圖6可知，不同測定方法得到的每種重金屬的EC50差異較大，有的甚至差1-5個數量級，這可能和不同測定方法本身的特點及測定條件有關。與發光細菌毒性測定相比，活性污泥脫氫酶毒性和硝化抑制毒性測定的靈敏度有些偏低。就重金屬Hg的EC50而言，發光細菌毒性、脫氫酶毒性和硝化抑制毒性基本表現為脫氫酶毒性>發光細菌毒性>硝化抑制毒性，其中脫氫酶毒性與發光細菌毒性差異不顯著(P>0.05)，發光細菌毒性和硝化抑制毒性差異不顯著(P>0.05);就重金屬Cd的EC50而言，基本表現為硝化抑制毒性>脫氫酶毒性>發光細菌毒性，其中不同細菌毒性差異均不顯著(P>0.05);就重金屬Zn和Pb的EC50而言，基本表現為脫氫酶毒性>硝化抑制毒性>發光細菌毒性，其中不同細菌毒性差異均顯著(P<0.05)。

　　3討論

　　本研究中，在不同濃度條件下，4種重金屬均可使污泥系統的CODCr去除率下降。其中，Cd和Hg對CODCr去除率的影響最明顯(其變化幅度較大)，而Zn和Pb對活性污泥CODCr去除率的影響較小，這與Zn和Pb在水中的離子形態有關，Zn和Pb可與溶液中的OH−結合，形成各種不具備生物活性的配位化合物。不同重金屬的外層電子排布不同，價態和離子半徑也有所區別，這對TF生成量的影響較大，并導致其對活性污泥脫氫酶活性的抑制能力產生較大差異。此外，由圖6可知，4種重金屬對活性污泥脫氫酶活性的抑制程度均隨著重金屬濃度的增加而降低，Cd對活性污泥脫氫酶活性的抑制作用大于Hg，這可能與Hg在溶液中可以形成多種配位化合物，進而影響其生物毒性，而Cd在溶液中通常以Cd2+或穩定性較低的絡合態存在，不會對其生物毒性產生較大的影響有關。Pb和Zn的EC50測定結果有些偏大，可能與這2種重金屬在水中的存在狀態有關，Pb和Zn可與溶液中的OH−結合，形成多種形式的配位化合物，另外由于金屬離子濃度較高時，會導致其與活性污泥顆粒上的H+產生交換，造成溶液pH升高，OH濃度升高，從而導致游離態的重金屬離子濃度降低。因此溶液中的Pb或Zn濃度表征的并不完全是具有生物活性的游離態離子濃度，故Pb和Zn的EC50測定結果偏大。

　　4種重金屬對活性污泥SVI值隨重金屬濃度的增加而升高，當重金屬濃度較低時，對活性污泥SVI值影響并不大，其原因可能是：(1)重金屬影響了活性污泥內微生物的細胞活性，降低了微生物自身的絮凝作用(鏡檢發現，重金屬存在時，活性污泥中的菌群發生變化，可能由于耐毒性較強的絲狀菌的存在使得活性污泥發生膨脹);(2)重金屬大量存在時，重金屬可置換出活性污泥中的H+，從而使環境pH值發生一定程度的下降，進而使活性污泥的沉降速度變慢(盧培利等，2008);因此在低濃度條件下，活性污泥SVI隨重金屬濃度增加變化不大，而高濃度條件下，活性污泥SVI值隨重金屬濃度的增加而顯著增加。4種重金屬對活性污泥硝化速率的抑制程度表現為Cd>Hg>Zn>Pb，與重金屬對活性污泥脫氫酶活性的抑制程度大小順序一致，這可能和這2種測定方法的受試對象是活性污泥，重金屬對活性污泥產生毒性的機理與發光細菌有所區別有關。活性污泥的硝化速率受重金屬毒性的影響比活性污泥脫氫酶活性更為敏感，而且其影響可量化，便于測定，因此可以作為污水脫氮工藝受重金屬毒性影響的指示指標。但因硝化細菌是一類比較敏感的菌群，受各種環境條件的影響較大，因此活性污泥的硝化速率是否可做為單一的重金屬毒性的終點指示指標還有待進一步驗證。

　　本研究中，不同測定方法得到的每種重金屬的EC50差異較大，有的甚至差1-5個數量級，這可能和不同測定方法本身的特點及測定條件有關(圖6)。與發光細菌毒性測定相比，活性污泥脫氫酶毒性和硝化抑制毒性測定的靈敏度稍微偏低，這可能和污水處理工藝的實際運行條件有關，進入污水中的重金屬經過各種轉化，如沉淀，被有機質、礦物質吸附或被水中大量無機(Cl−、OH−、NH3)及有機配位體(如腐殖酸)絡合而導致移動性降低，從而使重金屬的存在形態和毒性發生變化，導致重金屬毒性的測定結果產生偏差(陳同斌等，2003;謝冰，2002)。重金屬使發光細菌的發光強度降低，是由于其影響了發光細菌發光酶的催化代謝途徑;而重金屬對活性污泥脫氫酶活性的抑制，是由于有機污染物中活化的H+通過活性污泥的電子傳遞體系傳遞給特定的受氫體的過程受到了影響;而硝化速率受到抑制主要是因為硝化限速步驟氨氧化過程中的氨單加氧酶(AMO)的活性受到了影響(謝冰，2002)。由此可知，重金屬毒性測定方法、毒性評定對象的差異導致評定結果的差異，因此在實際運用中，應當根據具體的工藝原理和毒性評定對象特征，選擇合適的重金屬毒性測定方法。

　　由以上分析表明，多種重金屬毒性終點指示指標均可以提示重金屬對活性污泥微生物的毒性，例如，抑制BOD5或CODCr速率、活性污泥呼吸速率、活性污泥脫氫酶活性、活性污泥硝化速率及其細菌發光強度等，選擇終點有效的指標對重金屬對活性污泥微生物毒性進行評價，這逐漸成為眾多研究學者的共識。為了正確判斷重金屬對活性污泥微生物毒性的影響，應該選擇不同的毒性指標進行多組毒性測驗，不能將發光細菌發光強度的抑制指標作為主要的判斷標準，也不能僅僅追求速度，假如夸大重金屬對污水的處理能力，這將造成處理污水成本大幅度上漲。

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