植物抗黃瓜花葉病毒基因研究進展

發布時間：2020-01-20所屬分類：農業論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要:黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)作為世界十大植物病毒之一，嚴重危害多種作物的生產。相對于藥劑防治和使用轉基因品種，利用植物自身的抗性基因培育抗病品種是最為經濟有效的CMV防治方法。本文就相關內容從3個方面進行綜述:(1)R基因介導的植物

　　摘要:黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)作為世界十大植物病毒之一，嚴重危害多種作物的生產。相對于藥劑防治和使用轉基因品種，利用植物自身的抗性基因培育抗病品種是最為經濟有效的CMV防治方法。本文就相關內容從3個方面進行綜述:(1)R基因介導的植物抗病毒機制及已克隆的R基因;(2)植物抗CMV的R基因及分子機制;(3)植物中其他抗CMV相關基因的研究。

　　關鍵詞:植物;黃瓜花葉病毒;抗性基因

　　黃瓜花葉病毒(CMV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員，被列為世界十大植物病毒之一。黃瓜花葉病毒的寄主范圍廣，可侵染包括果樹、蔬菜和觀賞植物等100多個科的1000多種植物[1-2]。由于世界范圍內有些地區存在多種病毒混合侵染等情況，CMV對作物生產的危害程度很難進行總體量化。根據科研人員的統計，在中國CMV的侵染可導致番茄減產25%～50%[3];在西班牙CMV的侵染可導致甜瓜減產60%，辣椒減產達80%[4-5];在西班牙一旦番茄上出現CMV侵染引發的壞死，產量損失達到80%以上，甚至絕收[6-7]。

　　蚜蟲和種子帶毒是CMV傳播的主要途徑，而藥劑對病毒病的防治效果十分有限。利用基因工程技術進行抗CMV育種，具有周期短，不污染環境，抗性穩定等優點，但是轉基因作物的安全問題仍受到多方質疑[8]。利用植物自身的抗性基因對植物進行遺傳改良是最為經濟和有效的遏制CMV危害的途徑[9]。近幾十年來，國內外學者對植物抗黃瓜花葉病毒基因進行了廣泛和深入研究，并取得了一定的進展。本文就R基因介導的植物抗病毒病分子機制及已克隆的R基因植物抗CMV的機制和其他相關抗CMV基因的研究進展進行綜述，以期為植物抗CMV基因的深入分析和應用研究提供參考。

　　1植物的天然免疫系統

　　一般認為植物免疫系統由2個層面的免疫反應組成:(1)植物通過細胞表面的跨膜識別受體識別病原物相關分子(Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)所產生的免疫，稱為病原物相關分子激發的免疫(PAMP-triggeredimmunity，PTI);(2)植物體內的抗性基因(Rgene)通過特異地識別病原物效應因子所產生的細胞內免疫反應，稱為效應因子激發的免疫(Effector-triggeredimmunity，ETI)[10-11]。

　　1.1R基因介導的植物抗病毒機制

　　R基因介導的抗性是指R基因直接或間接識別特定病原物的無毒基因，激活植物防御反應。R基因介導的抗性可分為2種，一種稱為系統獲得性抗性(Systemacquiredresistance，SAR)，主要表現為在病毒侵染點及周邊組織引起程序性細胞死亡，活性氧爆發，細胞壁加厚，蛋白質磷酸化和去磷酸化以及大量防御基因的激活，隨后整株植物出現非專一性的、抗多種與起始侵染病毒相關或不相關的植物病原的抗性。在SAR過程中，病程相關(PR)基因等防衛基因大量表達，信號轉導因子水楊酸、茉莉酸、乙烯、一氧化氮等在植物抗病中起重要作用[11]。R基因介導的第2種抗性稱之為極端抗性(Extremeresistance，ER)或細胞水平抗性(Cellularresistance)，主要表現為有些R基因能夠快速響應病毒的侵入，抑制病毒的積累，將病毒的侵染限制在單細胞水平，植物表型癥狀為侵染部位僅有極小的壞死點[12]。典型代表為馬鈴薯Rx1基因介導的對馬鈴薯X病毒的抗性以及番茄Tm-22基因介導的對煙草花葉病毒抗性，侵染部位不出現肉眼可見的超敏反應[13-14]。

　　1.2植物中克隆的抗病毒R基因

　　目前已有多種植物病毒的抗性基因被克隆[15-16]，包括十幾個典型的NBS-LRR類病毒抗性基因，其中N基因和抗馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)基因Y-1為TIR-NBS-LRR類病毒抗性基因，其余均為CC-NBS-LRR類病毒抗性基因(表1)。此外，還克隆了幾個不屬于NBS-LRR類病毒抗性基因家族的病毒抗性基因，包括擬南芥抗煙草蝕紋病毒(Tobaccoetchvirus，TEV)基因RTM1、RTM2和RTM3[37-38]，番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)抗性基因Ty-1和Ty-3，番茄抗番茄花葉病毒(Tomatomosicavirus，ToMV)基因Tm-1[39]。

　　2植物中R基因介導的對CMV的抗性

　　2.1擬南芥中克隆的抗CMV的R基因及其抗性機制

　　擬南芥作為典型的模式植物，其CMV抗性基因克隆和機理研究最為廣泛和深入，典型代表是抗CMV的單顯性基因RCY1的研究。RCY1基因定位在5號染色體，可編碼一個相對分子量為1.04×105的CC-NBS-LRR蛋白質，與抗霜霉病的RPP8基因和抗蕪菁皺縮病毒的HRT基因為等位基因，抗性的發揮依賴于水楊酸(SA)和乙烯(ET)信號轉導通路，不依賴于茉莉酸(JA)信號轉導通路[26]。進一步研究發現SA和JA在調控RCY1功能方面存在拮抗作用，EDS5基因的表達和SA的積累在RCY1基因介導的抗性中發揮著重要作用[40-41]。RCY1基因表達量上調可顯著增強植株對CMV的抗性，抗性方式表現為“基因對基因”模式[42]。RCY1通過LRR區域與CMV的致病因子CP蛋白互作誘導抗性[43]。擬南芥中WARKY70通過與RCY1基因編碼的CC-NBS結構域互作，抑制CMV病毒的復制，減輕CMV的危害[44]。

　　推薦閱讀：哪些農業專業可以申請職稱

　　擬南芥中除典型的顯性抗CMV的R基因RCY1，還克隆了2個典型的隱性抗CMV的R基因cum1和cum2，對應的CMV病毒致病因子為Vpg蛋白質。cum1和cum2可編碼翻譯起始因子4E(eIF4E)和4G(eIF4G)蛋白質，eIF4E蛋白質可與真核mRNA5’帽子結構結合，eIF4G屬于支架蛋白質，能將eIF4E和起始因子結合形成eIF4F復合體，進而起始蛋白質合成。突變后的eIF4E不能和病毒移動蛋白質的mRNA結合，從而影響移動蛋白質的生成，限制病毒的移動[28]。

　　2.2其他植物中抗CMV的R基因及抗性機制

　　除擬南芥外，在其他植物主要是經濟作物的抗CMV基因定位和克隆方面也取得了較多進展。菜豆中同源克隆的RT4-4基因編碼一個TIR-NBS-LRR蛋白質，與CMV的2a蛋白質互作，引發過敏性壞死。該基因對番茄和辣椒上分離出的7個CMV株系具有抗性，但是對菜豆上分離的CMV株系無效[45]。2009年西班牙農業研究中心在甜瓜PI161375中鑒定出一個抗CMV基因cmv1[46]，2017年該研究中心克隆了cmv1基因，該基因可以編碼液泡分揀蛋白41，抗感材料間僅存在一個氨基酸差異(L348R)，是目前唯一與CMV在韌皮部運輸密切相關的隱性基因[47]。韓國科研人員在C.annuumcv.bukang中鑒定的抗CMV單顯性基因Cmr1位于2號染色體的著絲粒位置，與番茄抗番茄花葉病毒的Tm-1基因和番茄抗CMV的QTL(QRCMV2)具有同位性，亞細胞定位結果顯示Cmr1基因抑制了CMV病毒由葉表細胞到葉肉細胞的運動[48]。中國科研人員在C.frutescenscv.PBC688的2號染色體上定位到1個抗CMV主效QTL(qCmr2.1)，預測的候選基因與擬南芥中抗CMV基因RCY1同屬NBS-LRR家族基因，同時與煙草和番茄抗煙草花葉病毒基因N的同源性高達80%以上[49]。番茄抗CMV的QTL定位中發現2號染色體上的QTLQRCMV2與番茄抗番茄花葉病毒的Tm-1基因、辣椒抗CMV的Cmr1基因具有同位性[48，50-51];8號染色體上的QTL(QRCMV8)與馬鈴薯抗馬鈴薯S病毒的Ns基因具有同位性[51-52]。

　　3植物中其他相關基因介導的對CMV的抗性

　　植物通過多種基因協同作用形成的復雜調控網絡抵御病毒侵害。R基因與致病因子的互作觸發防御反應，多種基因的共同作用使植物獲得系統抗性。所以多方位研究相關基因的抗性機制，是對植物抗CMV分子機制研究的深入和完善。

　　3.1擬南芥中其他相關基因介導的對CMV的抗性

　　擬南芥中除抗CMV的R基因外，防衛基因、轉錄因子、信號因子、光受體等也參與對CMV的抗性防御。①防衛基因:AGO1蛋白是擬南芥中RNA誘導沉默復合體中的核心組件，是抵抗CMV侵染的關鍵因子。CMV中2b蛋白可以阻斷AGO1的酶切活性，限制miRNA途徑，減弱RNA沉默效應，從而達到侵染的目的[53]，擬南芥中過氧化氫酶基因CAT3與CMV的2b蛋白互作導致壞死斑的出現，CAT3基因的表達可增強擬南芥對CMV的抗性[54]。CMV的Fny株系的2b蛋白可以調控擬南芥中MircroR-NA159的表達水平誘發病癥[55]。②轉錄因子:擬南芥中轉錄因子HAT1在抵抗CMV防御反應中起負調控作用，其表達依賴于SA的積累[56]。③信號因子:擬南芥中NbbZIP28為CMV病毒侵染應激的UPR信號調控因子，但不是唯一調控因子，在病毒侵染早期，可提髙寄主基礎防衛反應，延緩病毒的侵染[57]。一氧化氮(NO)作為信號分子參與油菜素內脂介導的擬南芥對CMV的抗性反應[58]。④光受體:擬南芥光敏色素PHYB、向光素PHOT2基因顯著影響抗性相關基因的表達和抗氧化劑的活性，在抵抗CMV侵染中起著重要作用[59]。

　　3.2其他植物抗CMV的相關基因

　　在煙草、油菜和莧色藜等植物中發現多種防衛基因參與植物對CMV的抗性。煙草鋅指結構蛋白Tsip1與CMV1a和CMV2a蛋白結合形成復合體，抑制CMV的增殖[60]。煙草光敏色素信號通路通過調控內源SA信號通路發揮對CMV的抗性[61]。本氏煙熱激蛋白NbHsp70與CMV病毒復制酶1a相互作用，促進CMV的復制而有利于病毒的侵染[62]。油菜中BnSGS3基因超表達可以抑制CMV的病毒積累，減輕CMV危害[63]。莧色藜CaNDR1a和CaNDR1b的轉基因煙草對CMV的抗性增強，說明該基因參與了植物對病毒的內源免疫反應[64]。莧色藜CaNHO1基因可編碼一種甘油激酶，其基因表達量在接種CMV后顯著上調;轉CaNHO1基因煙草可顯著延緩CMV的晚期侵染，說明該基因參與了CMV誘導的防御抗性[65]。矮牽牛中轉錄因子PhERF2的表達可顯著抑制CMV外殼蛋白基因的表達水平，水楊酸和乙烯可顯著誘導該基因的表達，說明該基因可能是通過水楊酸和乙烯信號途徑發揮作用[66]。

　　4討論

　　綜上所述，植物中已克隆了多個病毒抗性的R基因，為植物抗病毒病的深入分析和應用研究奠定了良好的基礎。擬南芥抗CMV基因RCY1的研究為其他作物抗CMV基因的研究提供了較好的思路。但是由于技術局限性，從RCY1基因定位到分子機理的明確，整個研究歷程超過10年。此外，由于植物對CMV的抗性大多是數量性狀，其抗性機理更加復雜，研究歷程更加漫長。例如茄果類蔬菜(主要是辣椒和番茄)，自1997年Caranta等[67]在C.annuumcv.Perennial中首次定位到3個抑制病毒入侵的QTL以來，辣椒和番茄上仍未有抗CMV相關基因的克隆，其抗性機理更是模糊不清[68-69]。因此目前植物中克隆到的抗CMV的R基因仍然十分有限，抗CMV的分子機理仍需深入研究�？寺⌒碌目笴MV的R基因并闡明其分子機理仍然是植物抗CMV研究的重點，也是作物抗CMV育種的技術和理論基礎。

　　隨著科技的發展，技術的不斷革新，植物生物學研究方面的技術更加多樣化，效率也在不斷提高。首先，隨著測序技術的發展，多種作物的基因組數據陸續公布�；�于基因組數據產生的新基因定位技術(例如QTL-Seq、SLAF-Seq等)明顯提高了基因定位效率，基于基因組數據開發出的新一代高密度分子標記(例如SNP和Indel等)使基因定位更為準確，這些為深入研究基因功能和抗性機理奠定了很好的基礎[70-72]。在植物抗CMV基因定位方面，新技術的應用極為廣泛，僅從受CMV危害最為嚴重的茄科作物辣椒來看，自2014年辣椒基因組數據公布以來，利用高通量測序的方法，新定位到10個抗CMV相關QTL，相對于之前的定位研究，耗費時間更短，定位區間更為準確[73-76]。其次，CRISPR/Cas9技術引領了分子生物學研究領域中顛覆性的技術革新。2013年5個獨立的研究團隊證明CRISPR/Cas9系統在真核生物中具有功能[77-81]，最為重要的是研究證明該系統可以在多個位點同時實現高效的基因編輯[80-81]。由于CRISPR/Cas9技術具有簡單、高效和易操作等優點，CRISPR/Cas9在基因功能研究和種質創制上具有巨大優勢，在多種作物上已成功應用。例如在番茄上成功運用該技術編輯番茄早花基因SP5G，創制出可提早2周開花和果實成熟的番茄材料[82];美國冷泉港實驗室的科研人員利用該技術編輯SICLV3基因啟動子序列創制出系列番茄產量相關性狀的突變體材料，實現了對數量性狀更加微小的調控[83]。雖然目前還未有利用CRISPR/Cas9技術研究植物抗CMV分子機理的報道，但是利用該技術進行抗CMV分子機理研究是一種可行的思路，也是目前創制突變體材料及抗性種質材料最為高效的途徑。所以充分利用多種高效的生物技術實現植物抗CMV基因研究的突破，將是科研人員進一步研究和探索的重點。