UPLC波長(zhǎng)變換測(cè)定地榆飲片中沒食子酸、鞣花酸含量

發(fā)布時(shí)間：2020-01-07所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1286次

摘 要： 摘要:目的建立UPLC波長(zhǎng)變換測(cè)定地榆中沒食子酸和鞣花酸的方法，并對(duì)游離和水解樣品中的成分進(jìn)行分析。方法采用UPLC法，色譜柱為ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm50mm，1.7m)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果沒食子酸和鞣花酸的平均回收率分別為97.9%和

　　摘要:目的建立UPLC波長(zhǎng)變換測(cè)定地榆中沒食子酸和鞣花酸的方法，并對(duì)游離和水解樣品中的成分進(jìn)行分析。方法采用UPLC法，色譜柱為ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果沒食子酸和鞣花酸的平均回收率分別為97.9%和99.8%，RSD分別2.1%和1.6%(n=6)。結(jié)論所建立的方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠，游離沒食子酸和鞣花酸更適合作為地榆飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)。

　　關(guān)鍵詞:地榆;沒食子酸;鞣花酸;超高效液相色譜

　　地榆為薔薇科植物地榆SanguisorbaofficnalisL.或長(zhǎng)葉地榆SanguisorbaofficinalisL.var.longifolia(Bert.)YuetLi的干燥根[1]。地榆始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其味苦、酸、澀，性微寒。歸肝、大腸經(jīng)。具有涼血止血，解毒斂瘡的功效，用于治療便血，痔血，血痢，崩漏，水火燙傷，癰腫瘡毒等[1，2]。地榆主要化學(xué)成分為鞣質(zhì)和三萜類化合物，此外還有黃酮類、蒽醌類化合物[3，4]。

　　一般認(rèn)為鞣質(zhì)是地榆止血作用的主要活性成分[5]，但是實(shí)驗(yàn)表明口服給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大分子的單寧酸，止血作用較差;而沒食子酸和鞣花酸具有較好的止血活性[6，7]，故小分子的鞣質(zhì)類成分是與其止血功效密切相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此建立地榆中游離沒食子酸和鞣花酸的含量測(cè)定方法，為優(yōu)選更合理的地榆質(zhì)控指標(biāo)提供依據(jù)。

　　1儀器與試藥

　　1.1儀器WatersH-classUPLC全自動(dòng)高效液相色譜儀(含PDA檢測(cè)器);XS205D1/10萬(wàn)電子天平(梅特勒托利多);LC-350A型超聲波中藥處理機(jī)(濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠)。

　　1.2試藥沒食子酸對(duì)照品(批號(hào):110831-201302)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所、鞣花酸對(duì)照品(批號(hào)10149850)購(gòu)于美國(guó)阿法埃莎(AlfaAesar);乙腈(色譜純)購(gòu)于美國(guó)默克，磷酸(色譜純)購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，甲醇(分析純)購(gòu)于天津富宇精細(xì)化工有限公司。屈臣氏蒸餾水。

　　藥材:市售地榆飲片，經(jīng)本院中藥資源研究室林慧彬研究員鑒定為薔薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL.的干燥根。

　　2方法與結(jié)果

　　2.1色譜條件色譜柱:ACQUITYUPLCBEHC18柱(1.7μm，2.1mm×50mm);流動(dòng)相:A乙腈，B為0.1%磷酸水(0～0.7min，A1.5%→4%;0.7～1.7min，A4%→30%;1.7～3.5min，A30%→40%，3.5～5min，A40%→50%)。流速:0.6ml·min-1;柱溫35℃。波長(zhǎng):270nm/252nm。進(jìn)樣量:0.5μl。在上述色譜條件下，沒食子酸、鞣花酸對(duì)照品和供試品的色譜圖見圖1、圖2。

　　2.2溶液制備

　　2.2.1對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取沒食子酸、鞣花酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每毫升含沒食子酸0.10mg，鞣花酸0.45mg的溶液，即得。

　　2.2.2供試品溶液的制備稱取地榆粉末(過4號(hào)篩)約0.2g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理40min，放涼，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

　　2.3線性關(guān)系考察分別吸取不同體積的沒食子酸對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜中，測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出校正曲線，Y=5078154X-2979.6，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。結(jié)果表明，沒食子酸進(jìn)樣量在0.0198～0.2376μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

　　相關(guān)期刊推薦：《時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥》是經(jīng)國(guó)家科技部、國(guó)家新聞出版署批準(zhǔn)國(guó)內(nèi)外公開發(fā)行的綜合性中醫(yī)藥雜志。辟有基金項(xiàng)目、藥理藥化、炮制與制劑、國(guó)藥鑒別、臨床報(bào)道、中西醫(yī)結(jié)合、食療與護(hù)理、教學(xué)實(shí)踐與改革、英語(yǔ)園地、資源開發(fā)等20多個(gè)欄目。是從事中醫(yī)藥臨床、教學(xué)、科研和中醫(yī)藥生產(chǎn)專業(yè)人員發(fā)表學(xué)術(shù)見解、報(bào)道科研成果、交流工作經(jīng)驗(yàn)的園地，是廣大中醫(yī)藥工作者及中醫(yī)藥愛好者的益友。

　　分別吸取不同體積鞣花酸對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜中，測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出校正曲線，Y=9175392X+9142.6，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。結(jié)果表明，鞣花酸進(jìn)樣量在0.0123～0.1848μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

　　2.4精密度試驗(yàn)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，將沒食子酸和鞣花酸對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次0.5μl，測(cè)定沒食子酸的峰面積RSD為0.77%，鞣花酸的峰面積RSD為0.39%，表明精密度良好。

　　2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取供試品溶液，室溫條件下，分別在0，2，4，6，8，10，12，24h進(jìn)樣并進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積。結(jié)果沒食子酸在24h內(nèi)峰面積RSD為0.92%，鞣花酸在24h內(nèi)峰面積RSD為0.84%，表明該供試品溶液至少在24h內(nèi)穩(wěn)定。

　　2.6重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批次的地榆樣品粉末6份，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件精密吸取一定量的樣品溶液注入液相色譜儀，依法測(cè)定，計(jì)算沒食子酸和鞣花酸含量。結(jié)果沒食子酸和鞣花酸的含量分別為0.66%和0.89%，RSD分別為2.22%和2.17%，表明方法重復(fù)性良好。

　　2.7加樣回收率精密稱取已知含量的地榆樣品6份，分別加入沒食子酸和鞣花酸對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，計(jì)算沒食子酸和鞣花酸的平均加樣回收率，結(jié)果見表1，表2。

　　2.8樣品測(cè)定稱取地榆樣品粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積并計(jì)算各樣品中游離沒食子酸和鞣花酸的含量，見表3。

　　稱取地榆樣品粉末，按照《中國(guó)藥典》2015年版地榆項(xiàng)下沒食子酸含量測(cè)定方法，制備藥典法供試品溶液，按照，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積并計(jì)算各樣品中水解沒食子酸和鞣花酸的含量，見表3。

　　10批不同產(chǎn)地地榆飲片中，沒食子酸含量在0.07%～0.96%之間，鞣花酸含量在0.36%～1.28%之間;水解后沒食子酸含量在0.39%～4.65%之間，鞣花酸含量在0.09%～0.49%之間。

　　3結(jié)論

　　《中國(guó)藥典》2015年版地榆項(xiàng)下收載了沒食子酸的含量測(cè)定，其提取方法是以10%的鹽酸水解3h后，測(cè)定其水解產(chǎn)物中的沒食子酸含量，而本文所采用的提取方法是甲醇超聲提取，具有用時(shí)短，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。由測(cè)定結(jié)果可知，藥典法制備的樣品中沒食子酸含量高于本文所建立的方法，原因是地榆中含有大量沒食子鞣質(zhì)，在鹽酸的作用下，發(fā)生水解成了沒食子酸，使其含量升高;同時(shí)鞣花酸含量卻顯著降低，原因是鞣花酸的結(jié)構(gòu)中含有酯鍵，在酸水加熱的條件下發(fā)生水解從而引起結(jié)構(gòu)的變化。

　　采用UPLC法測(cè)定地榆中的沒食子酸和鞣花酸，最短可在3.5min內(nèi)完成一次測(cè)定，大大節(jié)約了時(shí)間;通過波長(zhǎng)變換的方法，可分別在沒食子酸和鞣花酸的最大吸收波長(zhǎng)270nm和252nm進(jìn)行測(cè)定，提高測(cè)定的準(zhǔn)確度。

　　采用SPSS軟件對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，K-S結(jié)果sig.=0.2>0.05，均服從正態(tài)分布。10批不同產(chǎn)地地榆飲片游離沒食子酸平均含量為0.457%±0.298%，鞣花酸平均含量為0.763%±0.356%，離散度均較大，不同產(chǎn)地地榆游離沒食子酸含量相差極大，最高者是最低者的10倍以上，而鞣花酸含量相差3倍左右，表明各地產(chǎn)的地榆質(zhì)量有較大差異。

　　一般認(rèn)為鞣質(zhì)是地榆止血作用的主要活性成分[5]，但是實(shí)驗(yàn)表明口服給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大分子的單寧酸，止血作用較差;而沒食子酸和鞣花酸具有較好的止血活性[6，7]，故小分子的鞣質(zhì)類成分是與其止血功效密切相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此建立地榆中游離沒食子酸和鞣花酸的含量測(cè)定方法，制定合理的含量限度對(duì)于提升地榆質(zhì)控指標(biāo)具有重要意義。將地榆飲片游離沒食子酸和鞣花酸平均值下浮20%，分別為0.366%和0.610%，若作為其含量限度，10批地榆飲片中，2號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)共四批樣品含量低于沒食子酸限度，2號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)共五批樣品地榆鞣花酸限度，因此在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)擴(kuò)大樣品量，為制定更合理的地榆質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支撐。

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