發布時間：2019-12-30所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：為調查分析進口蜂蜜中攜帶幼蟲芽孢桿菌的情況和菌株特性，本研究對2017年度來自10個國家和地區的71份蜂蜜樣品進行幼蟲芽孢桿菌分離并純化培養，將分離的菌株進行生化、16SrRNA基因鑒定和序列分析。結果顯示：分離的31株均為幼蟲芽孢桿菌，陽性率為43.6
摘要：為調查分析進口蜂蜜中攜帶幼蟲芽孢桿菌的情況和菌株特性，本研究對2017年度來自10個國家和地區的71份蜂蜜樣品進行幼蟲芽孢桿菌分離并純化培養，將分離的菌株進行生化、16SrRNA基因鑒定和序列分析。結果顯示：分離的31株均為幼蟲芽孢桿菌，陽性率為43.6%(31/71);16SrRNA基因序列分析結果顯示其與幼蟲芽孢桿菌(ATCC9545)等同源性在97%以上。31株分離株16SrRNA基因保守性強，同源性達99.8%以上，遺傳變異性較弱。本研究在國內首次為進口蜂蜜傳播美洲幼蟲腐臭病風險分析提供基礎數據，為制定進口蜂蜜風險控制措施提供依據。
關鍵詞：進口蜂蜜;幼蟲芽孢桿菌;分離鑒定
幼蟲芽孢桿菌(Paenibacilluslarvae)是一種革蘭氏陽性類芽孢桿菌，具有極強的生命力，可在蜂蜜[1]、蜂王漿、蜂膠和蜂花粉中存活，可引起美洲幼蟲腐臭病(Americanfoulbrood，AFB)。AFB是一種主要侵害蜜蜂幼蟲和蜂蛹的急性毀滅性傳染病，一旦發生極易造成蜂群衰弱及死亡，很難徹底清除，給養蜂業造成重大經濟損失[2]。在曾經暴發過該病的養蜂區域能存活長達35年，因此該病被OIE列入OIE疫病名錄(OIE-listediseases)，為必須通報的動物疫病[3]。通過對國內外蜂蜜的標準進行綜合分析，發現目前蜂蜜標準主要關注質量、安全、真實性等相關的指標，而忽略了蜂蜜可以傳播美洲幼蟲腐臭病的風險[4]，因此本研究對進口蜂蜜進行調查，并對分離株的16SrRNA基因進行生物信息學分析，為進口蜂蜜風險控制提供依據。
1材料與方法
1.1樣品及主要試劑2017年度寧波地區進口蜂蜜樣品71份，分別來自加拿大、澳大利亞、西班牙等10個國家和地區。MYPGP培養基(Mueller-Hintonbroth、酵母抽提物、K2HPO4、丙酮酸鹽、葡萄糖)由本實驗室配置并添加吡哌酸和萘啶酮酸;細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;2×EasyTaqPCRSuperMix(+dye)購自北京全式金生物技術有限公司。
1.2細菌的分離培養及鑒定按照OIE《陸生動物診斷實驗和疫苗手冊》2017版2.02.02的方法進行分離，蜂蜜樣品加熱至45℃～50℃，PBS或生理鹽水稀釋，80℃處理10min。離心棄上清液，留下約3mL液體，混勻后，取懸液200μL涂布于MYPGP平板，37℃培養7d～8d，挑選可疑菌落進行純化、觀察菌落形態、鏡檢和生化鑒定，生化鑒定參照國家行業標準SN/T1681-2011[5]。
1.316SrRNA基因擴增和序列分析按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書，提取細菌DNA作為模板，參照文獻[6]報道合成引物，并進行PCR擴增其16SrRNA，PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海派森諾生物科技有限公司測序，利用Blast和DNAStar對測序結果進行分析，并構建系統發育樹。
2結果與討論
2.1細菌的分離鑒定對采集的蜂蜜樣品進行分離培養，在71份蜂蜜樣品中共分離到菌株31株，詳見表1，陽性率達到43.6%(31/71)。分離菌在MYPGP平板上觀察到整齊、粗糙、扁平或突起的灰白色小菌落(圖1A)，鏡檢結果為革蘭氏陽性桿菌(圖1B)。生化反應結果與國家行業標準[5]結果一致(表1)。表明分離得到的細菌為幼蟲芽孢桿菌。
2.216SrRNA基因鑒定和序列分析細菌16SrRNA基因序列具有相對穩定和易變異的雙重特點，常用于細菌的分類鑒定，DirkGevers等的研究結果表明菌株之間16SrRNA的序列同源性≥97%的才有可能是同種細菌[7]。31株分離細菌的PCR產物約為1400bp(圖略)，經測序及比對分析結果顯示所有菌株的16SrRNA基因序列與P.larvae(ATCC9545)等標準菌株同源性大于97%，可以判定這些菌株均為幼蟲芽孢桿菌。
相關期刊推薦：《中國預防獸醫學報》(月刊)1979年創刊，影響因子和引文頻次均位居全國畜牧獸醫類期刊前列，多次被授予全國農業優秀期刊。辦刊宗旨:提高與普及相結合以提高為主.主要反映國內有關畜禽和經濟動物的傳染病防治和生物制品等的最新科研成果,交流工作經驗及防治畜禽傳染病的專業知識,促進我國獸醫科技的發展,更好地為畜牧業生產服務。有投稿需求的作者，可以直接與在線編輯聯系。
16SrRNA序列變化是微生物的系統發育和進化的重要的指示之一，本研究利用DNAStar軟件中MegAlign對包括31株分離株(分別來自于澳大利亞、法國，韓國、加拿大、羅馬尼亞、臺灣、西班牙、希臘、新西蘭、匈牙利)、3株ATCC保藏菌株(ATCC13537、ATCC25368、ATCC9545)，1株DSM保藏菌株(DSM3615)進行核苷酸比對和同源性分析。結果顯示31株分離菌的16SrRNA核苷酸序列同源性為99.8%～100%，具有較高的保守性和穩定性，遺傳變異較低。基于該基因的系統發育樹結果顯示，35株分離菌分成2個大分支，ATCC9545單獨一支，其原因可能是GenBank中ATCC9545的16SrRNA中存在多個兼并堿基原因。加拿大分離株(4株)、韓國分離株(1株)、臺灣分離株(1株)、澳大利亞分離株(1株)在同一分支;法國分離株(1株)和新西蘭分離株(1株)在同一分支(圖2)，由此表明幼蟲芽孢桿菌的16SrRNA比較保守，聚類分析發現基因差異較小，不適宜用作區分不同地理來源分離株的分子遺傳標記。
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