發布時間：2019-11-30所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要 桑樹因具有較強的耐水淹特性，近年來成為庫區消落帶植被恢復的備選樹種。 為探討飼料桑適應水淹脅迫的機理，以 2 年生盆栽飼料桑苗為對象，采取室內模擬水淹的方法，研究不同水淹時間和深度下桑苗葉片形態以及葉片內無氧呼吸酶(PDC、ADH、LDH)、抗氧化
摘 要 桑樹因具有較強的耐水淹特性，近年來成為庫區消落帶植被恢復的備選樹種。 為探討飼料桑適應水淹脅迫的機理，以 2 年生盆栽飼料桑苗為對象，采取室內模擬水淹的方法，研究不同水淹時間和深度下桑苗葉片形態以及葉片內無氧呼吸酶(PDC、ADH、LDH)、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的變化。 結果顯示：(1)根淹組桑苗在水淹期間葉片受害程度較輕，深淹組桑苗葉片在水淹 15 d 即出現萎蔫和黃化，至水淹結束后葉片基本全部腐爛、脫落。 但深淹組桑苗在水淹 75 d 后仍能萌發新芽，且淺淹組部分植株恢復生長狀況良好。 (2)相同水淹時間下，桑苗葉片內無氧呼吸酶和抗氧化酶活性隨水淹深度的增加均呈現顯著的上升趨勢(P<0.05)。 (3)桑苗葉片 SOD 酶活性在水淹 60 d 顯著上升，對照組和根淹組在水淹90 d分別降低了 3.49%和 9.22%，而 POD 和 CAT 酶活性在水淹 90 d 達到最大值，3 組處理下 2 種酶活性分別比水淹 30 d 增加了 8.03%、15.70%、10.23%和 12.05%、6.45%、9.15%，差異顯著(P<0.05)。 提高葉片無氧呼吸酶活性、增強 3 種抗氧化酶相互協調作用是桑苗水淹脅迫下的響應機制。 綜上，飼料桑苗具有良好的適應水淹脅迫能力，可作為三峽庫區消落帶植被恢復的備選樹種。
關鍵詞 飼料桑; 水淹脅迫; 葉片; 酶活性; 三峽庫區消落帶
消落帶是由水庫周期性蓄水形成的水位漲落區域，該區長期受到水、浪沖淘，原有土壤、植被條件遭受嚴重破壞，水土流失嚴重，是生境極其脆弱的過渡帶。 在水庫消落帶進行植被恢復是改善消落帶生態環境的重要途徑(盧剛等，2016)。 由于三峽水庫反季節周期性蓄水的特點，消落帶耐淹植物的篩選一直是該區生態修復的關鍵。 當前已經開展了較多關于耐淹植物篩選以及植物耐澇生理機制等方面的研究。 例如，研究發現，夏櫟(Quercus robur)可在其根皮層和不定根中形成通氣組織，具有較強的耐水淹能力(Parent et al.，2011);兩年生栗葉櫟(Q. casta⁃ neifolia)通過關閉葉片氣孔以防止組織過度脫水、生成不定根和莖皮孔以改善根系內部氣體交換等形態調節，可在水淹 60 d 后全部存活下來(Parad et al.，2016);秋華柳(Salix variegata)通過形成不定根、提高酶活性以降低活性氧的傷害(陳芳清等，2008)，在長達 90 d 的水淹脅迫下存活率達 100%，且表現出較強的光合和生長適應性(羅芳麗等，2007);中華蚊母樹(Distylium chinense)通過形成不定根、減少葉片數量等形態調整，增強自身耐水淹能力(劉澤彬等，2014)，在秋、冬季模擬水淹條件下苗木存活率達 100%(Liu et al.，2014);疏花水柏枝(Myricarialaxiflora)可通過自身休眠保證其生理活性不受到夏季水淹的影響(陳芳清等，2009)，并在部分水淹條件下能存活 150 d 以上(Yang et al.，2014);狗牙根(Cynodon dactylon)通過抑制自身的生長，降低可溶性糖、淀粉等碳水化合物的消耗(李秋華等，2013)，在水深 5 ～ 25 m、水淹脅迫 7 個月后存活率高達100%(劉送平等，2013);雙穗雀稗(Paspalum disti⁃ chum)、空心蓮子草( Alternanthera philoxeroides)、扁穗牛鞭草( Hemarthria compressa)、香附子( Cyperusrotundus)等草本植物可通過自身莖的伸長生長突破沒頂水淹(王海鋒等，2008;徐少君等，2008;劉送平等，2013)，具有很強的耐水淹性;香根草( Vetiveriazizanioides)通過停滯地上部分的生長以適應水淹環境，在沒頂淹沒 180 d 后存活率為87.5%(王海鋒等，2008);寬葉獨行菜(Lepidium latifolium)能夠在水淹脅迫下存活 50 d，維持較高的光合作用以及根系中可溶性糖的積累是其適應水淹環境的重要途徑(Chen et al.，2005)。 此外，還發現野地瓜藤(Ficustikoua)、蘇丹草( Sorghum sudanense) 等可以作為消落帶植被恢復的備選物種(馬利民等，2009)。 然而，這些研究大部分集中在耐淹草本和灌木的篩選上，對耐淹樹種的篩選研究則非常缺乏。
桑樹( Morus alba) 是桑科桑屬落葉喬木或灌木，喜溫暖濕潤氣候，耐干旱、水濕能力極強。 通過野外實地調查發現，根系發達的多年生桑樹在水深13.2 m、水淹脅迫 214 d 后，仍能存活并發芽展葉，形成新的樹冠(張建軍等，2012);通過室內模擬水淹試驗發現，1 年生飼料桑苗可以很好的適應根淹脅迫，適合生長在較高海拔的水庫消落帶(徐子棋等，2015);作為三峽庫區消落帶植被恢復的備選樹種，桑樹可通過增加側根數量適應水淹脅迫的低氧環境(李佳杏等，2012);在 2010—2013 年對三峽庫區消落帶原有桑樹的存活情況與利用現狀的調查中發現，海拔在 172 ～ 175 m 桑苗的整株成活率達 87%(黃先智等，2012);幼樹期飼料桑在完全淹沒的情況，能存活 50 d 左右、淹沒深度在 1 m 以上時，可存活 30 d 左右(孔瓊菊等，2013);此外，研究發現，在三峽庫區消落帶種植桑樹可以增強林地土壤的抗蝕性，對庫區消落帶生態修復有重要意義(郭天雷等，2015)。 本文以 2 年生盆栽飼料桑苗為研究對象，利用室內模擬水淹的方法，研究不同水淹時間和水淹深度下桑苗葉片形態以及部分酶活性的變化情況，以期從生理生態的角度揭示 2 年生飼料桑苗對水淹脅迫的適應機制，為三峽庫區消落帶耐淹樹種的篩選和生境的修復提供理論依據。
1 材料與方法
1 1 材料
試驗材料取自重慶市開縣渠口鎮大浪壩滄海桑苗基地，為自然生長的 2 年生飼料桑苗，于 2016 年8 月在苗圃將桑苗移栽到內徑 29 cm、高 23 cm 的花盆中(每個花盆中移栽 1 株桑苗)，花盆內土深 12cm、埋根深度 10 cm。 栽植桑苗使用的土壤為氮磷鉀酶活性≥6%、有機質≥45%、pH 值為5.5～6.5、有效活菌數≥2×107copies·g-1的育苗基質。 為保證苗木正常生長，予以澆水和管理。 于 2016 年 12 月選擇長勢良好的桑苗(平均株高為 56.38 cm、平均地徑為 8.26 mm)進行水淹脅迫試驗。
12 試驗設計
根據水淹深度設置 3 組處理，分別是：對照組(CK)、根淹脅迫組(GY)和深淹脅迫組( SY)，每組處理有 10 株桑苗(每組處理選擇的桑苗長勢基本一致)。 其中，根淹脅迫組和深淹脅迫組放置在水箱內進行水淹脅迫，水箱內的水深分別為 14 和 50cm (即水淹深度超過花盆內土高 2 和 38 cm)，對照組放置在水箱旁光照充足的空地上。 試驗過程中保持通風，水淹開始后每 5 d 更換一次水箱內的水、對照組澆水 600 mL。 與此同時，每 5 d 觀察水淹脅迫下桑苗的外部形態特征，拍照記錄。 水淹脅迫試驗于 2017 年 3 月結束，歷時 3 個月。 水淹脅迫試驗結束后將深淹組和根淹組桑苗重新放置在光照充足的室內，每 5 d 澆水一次，觀察并記錄其水淹脅迫后的恢復生長情況。
1 3 指標測定
在水淹期間，每 15 d 觀測 3 組不同水淹深度處理下桑苗的葉片形態變化情況，包括卷曲或萎蔫的葉片數量、黃葉數量、落葉數量以及產生褐斑或腐爛的葉片數量，詳細記錄并拍照。
分別于 2017 年 1 月 6 日(水淹 30 d)、2017 年 2月 5 日(水淹 60 d)、2017 年 3 月 7 日(水淹 90 d)進行取樣。 取樣時選取桑苗植株上完整、新鮮的葉片，剪下后清洗干凈并擦干水分，每株桑苗稱取不少于300 mg 的葉片樣本，裝入保鮮袋，保存在冰箱中。測定的指標包括：超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶( POD)、 過 氧 化 氫 酶 ( CAT )、 丙 酮 酸 脫 羧 酶(PDC)、乙醇脫氫酶(ADH)和乳酸脫氫酶( LDH)，指標的測定均采取酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，酶活性單位為 U·mL-1。 將樣本葉片在冰冷的 PBS中漂洗，濾紙拭干，準確稱重，按重量與體積為 1 ∶ 4的比例加入 4 倍體積的勻漿介質于勻漿管中，在冰水浴條件下盡快剪碎樣本葉片，進行勻漿。 將制備好的 20%勻漿液用離心機(4000 r·min-1)離心 20min，取上清液。 取板條并設置標準品孔和樣本孔：標準品孔各加不同濃度的標準品 50 μL，樣本孔先加待測樣本 10 μL，再加樣本稀釋液 40 μL，空白孔不加。 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體 100 μL，用封板膜封住反應孔，用 37 ℃ 水浴鍋水浴 60 min 后棄去液體，用洗板機洗板，每孔加入底物 A、B 各 50 μL，37 ℃避光孵育 15 min。 最后在每孔中加入終止液 50 μL，于 15 min 內在 450 nm 波長處測定各孔的OD 值。 計算出標準曲線的回歸方程，將樣品的 OD值代入方程式，計算出樣品濃度。 每個樣品重復測定 3 次，取平均值。
1.4 分析方法
試驗數據分析使用 EXCEL 2010 表格進行整理和繪圖，采用 SPSS 17.0 對不同處理的數據進行單因素方差分析(one⁃way ANOVA)，用 Duncan 法進行多重比較(顯著性水平為 0.05)。
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2 結果與分析
2 .1 水淹脅迫對桑苗葉片形態的影響
水淹脅迫對2年生桑苗葉片形態的影響見表1、 圖 1。 在整個水淹期間，對照組桑苗的葉片形態基本無變化，僅在水淹 60～90 d 出現輕微的落葉現象;水淹脅迫 15 d 后根淹組和深淹組分別有 2 個和 8個葉片邊緣變黃，深淹組的 10 個葉片出現輕微的卷曲、萎蔫現象;水淹 30 d 深淹組有 19 個葉片產生褐斑，且落葉現象加劇，根淹組有少量葉片出現卷曲和萎蔫;水淹 60 d 后深淹組出現較為明顯的澇害癥狀，葉片持續萎蔫脫落，且有大量葉片形成褐斑并腐爛;而水淹 75 d 后深淹組的一株桑苗在距水面較近的莖頂處有 2 個新芽萌發;水淹脅迫 90 d 后，深淹組桑苗葉片澇害癥狀顯著，葉片基本全部腐爛、脫落。 水淹脅迫結束后恢復生長 15 d 根淹組和深淹組分別有 3 株和 1 株桑苗開始萌發新芽，且此后 4株桑苗恢復生長狀況良好。
2.2 水淹脅迫對桑苗葉片抗氧化酶活性的影響
由圖 2 可以看出，在相同的水淹時間下，桑苗葉片 SOD、CAT、POD 酶活性均隨水淹深度的增加而顯著上升(P<0.05)。 對照組和根淹組 SOD 酶活性隨著水淹時間的增加出現先顯著增加后下降的趨勢，水淹 60 d 達 到 最 大 值， 分 別 比 水 淹 30 d 增 加31.88%和 16.46%，差異顯著(P<0.05)，深淹組 SOD酶活性在整個水淹期間呈現出無顯著性差異的增長趨勢，其在水淹 60 和 90 d 分別比水淹 30 d 增長了5.27%和 5.84%;深淹組和對照組 CAT 酶活性隨水淹時間的增加均有所升高，根淹組 CAT 酶活性在水淹 60 d 增加 11.7%，差異顯著(P<0.05)，水淹 90 d比 60 d 又降低了 4.7%;根淹組 POD 酶活性隨水淹時間的增加顯著升高，深淹組 POD 酶活性隨水淹時間的增加呈現出先下降后顯著增加的趨勢，對照組POD 酶活性在水淹 60 d 達到最大值，比水淹 30 d增加了 15.19%，差異顯著(P<0.05)，在水淹 90 d 又降低了 6.21%，無顯著差異。
2.3 水淹脅迫對葉片無氧呼吸酶活性的影響
由圖 3 可以看出，在相同的水淹時間下，隨著水淹深度的增加，桑苗葉片 ADH、LDH、PDC 酶活性均呈現出顯著的增加趨勢(P<0.05)。 且隨著水淹時間的增加，3 種水淹深度處理下的 ADH 酶活性均呈現增長趨勢，對照組 ADH 酶活性在水淹 60、90 d 分別比 30 d 升高了 17. 07%、 36. 39%，差異顯著 ( P<0.05)，根淹組和深淹組 ADH 酶活性在水淹 90 d比水淹 30 d 分別顯著增加了 8.9%和 8.25%;深淹組LDH 酶活性在水淹 60 d 有所降低，在水淹 90 d 又升高了 5.94%，差異顯著(P<0.05)，根淹組和對照組 LDH 酶活性隨著水淹時間的增加均有所升高，根 淹組無顯著性差異，對照組在水淹 90 d 比 30 d 增加了 4.83%，差異顯著(P<0.05);對照組 PDC 酶活性隨水淹時間的增加呈現升高的趨勢，在水淹 90 d 比30 d 增加了 9.88%，差異顯著(P<0.05)，而根淹組在整個水淹期間無顯著差異，深淹組 PDC 酶活性在水淹 60 d 降低了 3.43%，水淹 90 d 又上升了 6.6%，差異顯著(P<0.05)。
3 討 論
3. 1 水淹脅迫下桑苗葉片的形態變化
水淹對植物造成傷害的主要原因是缺氧，缺氧將能量代謝從好氧模式轉化為厭氧模式，使植物出現萎蔫現象( Sairam et al.，2008)，且長期無氧呼吸導致植物體內乙醇、乳酸、乙醛等有害物質大量積累，嚴重威脅植物的生長(李彥杰等，2014)。 研究發現，葉片脫落是闊葉和常綠樹種應對水淹環境的一種自我保護機制( Parolin et al.，2010)。 本研究中，3 組處理的桑苗均出現了不同程度的落葉現象，其中深淹組在水淹 30 d 即出現嚴重的落葉現象，而根淹組在水淹 45 d 才開始落葉，且深淹組的落葉現象在整個水淹期間均顯著嚴重于根淹組。 根淹組在水淹初期葉片形態無明顯變化，至水淹 30 d 才有少量葉片出現卷曲和萎蔫現象，水淹結束后仍有部分葉片保持完整、健康。 深淹組葉片在水淹 15 d 開始出現萎蔫、黃化現象，水淹 30 d 后受害程度加劇，至水淹結束葉片基本全部腐爛、脫落，說明深淹對桑苗造成的傷害比根淹更嚴重。 然而，在水淹 75 d 深淹組的桑苗頂端接近水面處有新芽萌發，可見桑苗對深淹脅迫亦有良好的適應能力。 此外，水淹結束后部分桑苗恢復生長狀況良好，表明 2 年生飼料桑苗具有很強的水淹耐受性，可以作為三峽庫區消落帶植被恢復的備選樹種。 張建軍等(2012)研究發現，1 年生桑苗在經歷 90 ～ 118 d 沒頂淹沒后仍能正常萌發，根系發達的多年生桑苗在水深 13.2 m、水淹214 d 后能存活并發芽展葉，該結果與本研究相似。而徐子棋等(2015)研究認為，1 年生飼料桑苗對根淹脅迫有很好的適應能力，但無法適應長期沒頂淹沒，該結果與本研究不同，其原因可能是試驗選用桑苗的苗齡不同。 可見，桑苗的品種、年齡等因素亦影響其耐淹特性，因此，今后有必要開展不同品種、不同年齡桑苗在冬漲夏落型水淹脅迫生境下的耐淹特性和生理生態學機制的研究。
3. 2 水淹脅迫下桑苗葉片的酶活性變化
水淹脅迫造成的缺氧會阻礙植物細胞內電子鏈的正常傳遞過程，導致植物體內活性氧產生及清除的平衡遭到破壞，過氧化物和超陰負離子的大量積累是導致植物生長受害的重要原因( Zhang et al.，2007;蔡 金 峰 等， 2008; 李 彥 杰 等， 2014; 李 艷 等，2016)。 抗氧化酶能夠降低植物在逆境條件下的受害程度、維持其生存和生長。 試驗結果顯示，根淹組和深淹組桑苗葉片抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均顯著高于對照組，這表明桑苗通過提高葉片內抗氧化酶活性以適應水淹脅迫。 且隨水淹深度的增加，3 種酶活性呈現出顯著的增加趨勢，這是因為水淹深度越深其對植物的生長和光合作用產生的危害越大。 這與水淹處理下雙穗雀稗 CAT、SOD、POD 等酶活性都隨著水淹深度的增加而增加(譚淑端等，2013)、在生長季水淹過程中， 中山杉葉片 SOD、CAT、POD 酶活性均隨水淹深度的增加顯著增加(張艷婷，2016)研究結果一致。 此外，2 年生飼料桑苗葉片 SOD 酶活性在水淹前期顯著升高，在水淹 90d 又呈現下降的趨勢，而 CAT 和 POD 酶活性在水淹90 d 顯著升高，這表明在水淹前期，桑苗通過提高SOD 酶活性以降低超陰離子自由基的傷害，但隨水淹時間的延長，高活性的 SOD 酶會導致植物體內H2O2 的大量積累，損壞植物細胞功能(朱翠英等，2015)，而過氧化物的清除需要依賴 CAT 和 POD 兩種酶的共同作用(田小磊等，2005)。 葉片 3 種抗氧化酶的這種相互協調作用是桑苗耐水淹脅迫的一種響應機制。
無氧呼吸酶與植物的耐水淹性密切相關(張艷婷等，2016)。本試驗結果顯示，與對照組相比2年生飼料桑苗葉片中 PDC、ADH 和 LDH 酶活性在水淹脅迫下均顯著升高，說明水淹脅迫形成的低氧環境使桑苗由有氧呼吸轉化為無氧呼吸。在相同水淹時間下，深淹組無氧呼吸酶的活性顯著高于根淹組，且隨水淹時間的延長3種酶的活性也表現出了較為顯著的增加趨勢，在水淹 90 d 達到最大值,表明桑苗葉片無氧呼吸酶的活性與其受水淹脅迫的程度呈正比。這與不同水淹脅迫處理下中山杉葉片中的3種無氧呼吸酶活性均隨水淹深度增加而顯著增加(張艷婷等，2016)、水淹脅迫導致濕生藍果木根尖形態組織 ADH 活性增加(Angelov et al.，1996)、大豆根系中 ADH 活性在水淹脅迫下增加( Komatsuet al.，2011)等結果基本一致。
4 結 論
不同深度處理下的桑苗在水淹脅迫下均出現了不同程度的落葉現象。 根淹組桑苗在水淹期間其葉片受害程度顯著輕于深淹組，但深淹組桑苗在水淹75 d 后仍能萌發出新芽，且根淹組部分植株在水淹結束后恢復生長良好。 因此，2 年生飼料桑苗具有很強的耐水淹能力。
水淹脅迫會導致 2 年生飼料桑苗葉片的抗氧化酶和無氧呼吸酶活性顯著升高。 無氧呼吸的酶活性隨水淹時間和水淹深度的增加均呈現出了顯著的增加趨勢，其活性可反映桑苗受水淹脅迫的程度，而SOD 與 CAT、POD 三種抗氧化酶通過相互協調作用以降低水淹對桑苗造成的傷害。
本研究表明，2 年生飼料桑苗表現出良好的適應水淹脅迫的能力，可作為三峽庫區消落帶生態修復的備選耐淹樹種。
SCISSCIAHCI
