發布時間：2021-09-13所屬分類：免費文獻瀏覽：1次
摘 要： 中國病原生物學雜志
《呼吸道合胞病毒感染患兒臨床特征及免疫功能分析》論文發表期刊：《中國病原生物學雜志》；發表周期：2021年04期
《呼吸道合胞病毒感染患兒臨床特征及免疫功能分析》論文作者信息：褚麗敏（1980-），女，河北邯鄲人，醫學學士，河北醫科大學第一醫院副主任護師。研究方向：呼吸系統。
【摘要】目的 分析呼吸道合胞病毒(RSV)感染患兒的臨床特征及免疫功能，為臨床抗感染提供指導。方法 選取68例呼吸道感染患兒為觀察組，74例健康體檢兒童為對照組，分析感染患兒免疫球蛋白和T細胞亞群水平。收集呼吸道感染患兒鼻咽抽吸物樣本，采用直接熒光定性檢測樣本中病毒，PCR擴增檢測RSV臨床分型。結果 68例呼吸道感染患者中，感染呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、流感病毒、腸道病毒、混合型的患者分別為36、11.9、7，3和2例。36例RSV感染患兒中，A亞型26例，B亞型10例。男性患兒25例，女性患兒11例。0~、1~、3~和6~14歲組患兒檢出率分別為36.11%，27.78%，22.22%和13.89%，0-1歲組與其他年齡組相比，差異有統計學意義(x2=5.5556，F=0.0184)，RSVA和RSVB在不同年齡呼吸道感染患兒中均有分布。春夏秋冬四季患兒RSV檢出率分別為30.56%，13.89%，22.22%和33.33%。(X2=8.0000，P=0.0047)，RSVA和RSVB在各季節中均有流行分布。68例觀察組患兒1gG2、IgG4、IgM、IgE水平明顯低于對照組(均P<0.05)，T細胞亞群CD3+，CD4+、CD4+/CD8+、CD19+水平均低于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)，提示病毒感染引發患兒機體內免疫功能紊亂。結論 兒童呼吸道感染病毒類型主要為呼吸道合胞病毒，冬季是病毒感染的流行季節。積極監測病毒感染情況，對抗病毒治療具有指導意義。
【關鍵詞】呼吸道感染;患兒;呼吸道合胞病毒;基因分型;免疫功能
[Abstract]
Obiective To analvze the clinical characteristics and immune function of pediatric patients with a respiratory tract infection in order to guide the clinical treatment of infection. Methods Sixty-eight children with a respiratorytract infection served as the observation group, and 74 healthy children served as the control group. The levels of immunoglobulins and T-cell subsets in children with an infection were analyzed. Nasopharyngeal aspiration samples from children with a respiratory tract infection were collected, the virus in the samples was determined qualitatively with direct fluorescence, and the clinical typing of respiratory syncytial virus (RSV) was accomplished via amplification with PCR Results Among the 68 pediatric patients with a respiratory tract infection, 36 were infected with an RSV. 11 were infec ted with a parainfluenza virus, 9 were infected with an adenovirus, 7 were infected with an influenza virus, 3 were infected with an enterovirus, and 2 had a mixed infection. Of the 36 pediatric patients infected with an RSV. 26 were infected with the RSVA subtype and 10 were infected with the RSVB subtype. Pediatric patients consisted of 25 males and 11 females. The rate of detection was 36.11% in children ages 0-1, 27.78% in children ages 1-3, 22.22% in children ages 3-6, and 13.89% in children ages 6-14. The status of the RSV infection differed significantly between children ages 0-1 and the other age groups (X2=5.5556, P=0.0184). RSVA and RSVB were distributed in children of different ages with a respir atory tract infection. RSV was detected at a rate of 30.56% in the spring, 13.89% in the summer, 22.22 % in the autumn, and 33.33% in the winter. The rate of detection in the winter differed significantly from that in other seasons (X2=8.0000, P=0.0047), RSVA and RSVB were distributed during all seasons. The levels of IgG2, IgG4, IgM, and IgE in the 68 children in the observation group were significantly lower than those in the control group, and levels differed significantly according to a t test (P<0.05 for all). The levels of CD3+, CD4+, CD4+/CD8+, and CD19+ cells in the childrer with a respiratory tract infection were significantly lower than those in the control group, and levels differed significantly according to a t test(P<0.05 for all)，suggesting that viral infection caused immune dysfunction in the children with an infection. Conclusion The type of virus causing a respiratory tract infection in children was mainly RSV, and viral imfections were prevalent during the winter. Active monitoring and treatment of viral infections is crucial.
[ Key words respiratory tract infection; pediatric patients; RSV; genotyping; immune function
呼吸道感染是兒童最常見臨床疾病類型之一，臨床病毒感染是患兒呼吸道感染的重要病原體，常見呼吸道病毒類型有呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)，腺病毒(adenovirus，ADV)，流感病毒(influenza virus，Inf)，副流感病毒(parainfluenza virus，Pinf)等[1]。目前，RSV是臨床呼吸道感染患兒檢出率較高的病原體。兒童發生RSV呼吸道感染患者，有兩個典型特征，即RSV可以感染存在母體抗體保護的嬰兒，并且可以導致兒童發生反復感染。有報道稱[2]，RSV毒株變異是導致兒童發生反復RSV感染的主要原因，患兒再次感染RSV時，機體產生的免疫反應無法有效阻止變異病毒再次感染患者，因此積極監測兒童RSV呼吸道感染型別，對患兒RSV感染的有效臨床防治具有重要意義。
材料與方法
1臨床資料
收集醫院就診的呼吸道感染患兒臨床資料68例，包括急性上呼吸道感染患兒、急性支氣管炎患兒、急性喘息性支氣管炎患兒、大葉性肺炎患兒、哮喘合并感染患兒等。同時選取74例健康體檢兒童作為對照組。本研究已通過醫院倫理委員會標準，患兒家長愿意接受此次調查，且已經簽署知情同意書。
2主要試劑與儀器
病毒RNA小量提取試劑盒購自Qiagen公司;SuperScript TMII逆轉錄酶試劑盒購自Invitrogen公司;r-Taq聚合酶等分子試劑購自Takara公司;無水乙醇等試劑購自Sigma公司;瓊脂糖購自Promega公司;低溫離心機購自Eppendorf公司;PCR擴增儀、電泳儀購自Bio-Rad公司;流式細胞儀及試劑盒購自美國BD公司。
3病毒檢測與分型
3.1 標本收集 收取入選患者在住院3d內或門診就診當天的標本，采用一次性無菌吸痰管，經患者鼻腔插至7~8cm至其咽部以下，負壓吸取深部鼻咽抽吸物(NPA)1~2 ml，加入少量無菌生理鹽水，置于無菌收集管中，于超凈臺中加入2 ml的病毒保護液，混勻。
病毒保護液由200 U/ml鏈霉素、200 U/ml青霉素、
200 U/ml兩性霉素B以及0.125%的BSA液組成。
將樣本存于-70℃低溫冰箱，保存待測。
3.2 病毒檢測 采用直接熒光定性檢測樣本中病毒。結果判定：200×顯微鏡觀察，在每個視野中找到兩個及以上的綠色熒光細胞，即判定為陽性，染色顯示為暗紅色的判定為陰性細胞;對于兩種及以上病毒感染樣本判定為混合感染。
3.3 PCR擴增分型 標本處理：室溫解凍樣本，高速渦旋振蕩后，轉至2ml EP管中，10 000 r/min(離心半徑8.7 cm)離心5 min后，上清液用于病毒核酸提取。
病毒RNA提�。喝�140 pl樣本上清液，加入RNA載體(AVL)，高速渦旋振蕩15 s，室溫條件下靜置10 min后，10 000 r/min(離心半徑8.7 cm)離心2min;加入560 pul無水乙醇，高速渦旋振蕩15 s，10 000r/min(離心半徑8.7 cm)離心5 min;取630 4l液體置于離心柱中，10 000 r/min離心2 min;加入500 plAW1洗液，10 000 r/min(離心半徑8.7 cm)離心5min;加入500 ul AW2洗液，離心;加入60 pl AVE，室溫放置1 min后10000 r/min(離心半徑8.7 cm)離心5 min.
逆轉錄反應體系：取病毒總RNA液21 pl，隨機引物1 p1，10 pmol/L dNTPs 2 pl，共24 pl，于65℃進行逆轉錄反應5 min;將反應液置于冰盒上，加入16pl反應液，即RNase Out 1 p1、SSII反轉錄酶1 pl.5×buffer 8 l、0.1 mol/L dTT 4 pl，ddH20 2 ul;逆轉錄反應條件：25 ℃ 12 min，42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min即得cDNA模板液。
PCR擴增反應液：病毒CDNA液2.5 ul，r-Taq DNA聚合酶0.25 1l，dNTPs 2 4l，10 × buffer 2.5 gl，上下游引物各0.5 pl，ddH20補至25 pl;PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃延伸30s，72 ℃延伸45 s，40個循環;72 ℃終延伸5 min，引物序列見表1
3.4 PCR產物檢測 取PCR擴增產物，于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，在120 V電泳30 min后，經凝膠成像儀觀察拍照。并將PCR產物送大連寶生物公司測序。
4免疫指標監測
在空腹狀態下，抽取兒童肘靜脈血5 ml，將其中3ml置于不抗凝的無菌試管中，離心后收集血清樣本，低溫保存待測。采用免疫散射比濁法，分析患者免疫球蛋白水平，采用流式細胞儀測定患者T細胞亞群表達水平。
5統計學分析
采用統計學軟件，對數據進行統計學分析，卡方檢驗和1檢驗分析差異顯著性，以P<0.05判定為差異顯著性。
結果
1患兒呼吸道感染病毒類型
68例呼吸道感染患者中，感染呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、流感病毒、腸道病毒、混合型的患者分別為36，11.9.7、3和2例，占52.94%，16.18%、13.24%，10.29%、4.41%和2.94%。呼吸道合胞病毒是患兒呼吸道感染的主要病毒類型。
2 RSV不同型別感染患兒臨床特征
36例RSV感染患兒中，RSVA亞型感染患者26例，RSVB亞型感染患者10例，A型是患兒呼吸道感染主要RSV型別。RSV感染者中男性患兒25例，女性11例，男性多于女性患兒，差異有統計意義(X210.8889，Р<0.05).不同年齡組患兒RSV感染情況見表2。隨著年齡增長，RSV檢出率呈下降趨勢。其中0~歲患兒RSV檢出率最高，為36.11%，1~，3~和6~14歲組患兒檢出率分別為27.78%、22.22%和13.89%.0~1歲患兒是RSV易感人群，與其他年齡患者RSV感染情況相比，差統計意義(X2=5.5556，P=0.0184)，RSVA和RSVB在不同年齡呼吸道感染患兒中均有分布，并且，在0~1歲呼吸道感染患兒中仍以RSVA型為主要流行型別。
不同季節患兒RSV感染情況見表3。春夏秋冬四季患兒RSV檢出率分別為30.56%、13.89%、22.22%和33.33%。冬季是呼吸道患兒發病的流行季節，與其他季節相比，差異有統計學意義(X2=8.0000，P=0.0047)，RSVA和RSVB在各季節中均有流行分布，但RSVA在流行季節(冬季)的檢出率明顯高于RSVB型。
3受試兒童免疫球蛋白水平
74例對照組和68例觀察組兒童免疫球蛋白水平見表4。呼吸道感染患兒1gG2、IgG4，IgM、IgE水平明顯低于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)，提示病毒感染引發患兒機體免疫能力降低。
4受試兒童T細胞亞群水平
74例對照組和68例觀察組T細胞亞群水平見表5。呼吸道感染患兒CD3+.CD4+、CD4+/CD8+、CD19+水平明顯低于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)，提示病毒感染引發患兒機體內免疫功能紊亂。
討論
在世界范圍內，呼吸道感染是威脅兒童健康的常見疾病，臨床病毒感染是患兒常見病原體。本研究調查患兒呼吸道感染病毒類型發現，呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、流感病毒、腸道病毒等在臨床呼吸道感染患兒中均有發現，其中呼吸道合胞病毒仍然占據主要地位。RSV是兒童呼吸道感染的最重要病原體之一，是引發兒童肺炎及毛細支氣管炎疾病的主要病原。然而，目前還未研制出有效的疫苗可以預防RSV感染，因而積極監測臨床感染，調查RSV呼吸道感染患兒臨床特征，對預防RSV感染具有重要意義[3]。本研究調查中，監測到病毒混合感染樣本，這可能是由于一種病毒侵入患兒體內，導致患兒發生病毒感染后，患兒呼吸道黏膜結構發生改變，更易于其他病毒侵入、定植導致的。對于病毒混合感染患者，患兒病情嚴重，抗感染治療較難，應給予高度重視[]
RSV屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，是單股負鏈的非節段性RNA病毒。RSV核苷酸至少編碼10種特異性蛋白，如兩個基質蛋白(M，M2)、三個跨膜蛋白(G、F、SH)、兩個非結構蛋白(NS1.NS2)以及三個核衣殼蛋白(N，P、L)[]。目前，根據吸附蛋白(G)、磷蛋白(N)、和蛋白(N)、小疏水蛋白(SH)序列的變異數量及長度，可以將RSV分為A(RSVA)，B(RSVB)兩個亞型[-]。本研究發現，盡管RSVA和RSVB型在兒童呼吸道感染患者樣本中均有分布，但A型更多見。這可能是由于RSVA亞型變異程度比RSVB亞型高導致的]。本研究中，發生RSV呼吸道感染的患兒中，男性患兒居多，這與以往研究報道一致。并且，多數RSV呼吸道感染患者年齡小于1歲，隨著年齡增長，患兒RSV感染率降低。這是由于小于1歲的患兒機體免疫能力尚未發育完善，無法及時形成充足的抗體清除病毒，導致患者病毒感染陽性率較高[10.RsV流行具有明顯的季節性分布特征，冬季是RsV流行高峰期，春秋季節次之，夏季RSV呼吸道感染發病率最低;另外，RSVA在感染流行季節中比RSVB分布率高，這可能與RSVB可以激發患者更完全或更持續的特異性免疫反應有關[
反復呼吸道感染在兒科患者中較為常見，發病率高達20%，患兒病情容易反復發作，機體長期處于免疫功能低的狀態，嚴重影響兒童器官、系統的正常發育及功能[12，隨著兒童年齡增長，其機體免疫力增強，臨床發病率降低，因而兒童機體免疫功能紊亂等因素是導致兒童反復呼吸道感染發病的重要影響因素[1-1]，呼吸道感染患兒體內免疫水平降低，表明患兒體液免疫功能紊亂。與對照組相比，呼吸道感染患兒體內的1gG2.lgG4、IgM、IgE水平明顯降低，表明呼吸道感染患兒體內存在免疫缺陷。有報道稱[，1gG2，IgG4免疫缺陷是患兒呼吸道感染反復發作的主要機制。因此，積極監測患兒體內免疫球蛋白水平，重視1gG2、IgG4等引起的免疫缺陷患者，可以有效預防患兒發生反復呼吸道感染。反復呼吸道感染患兒體內T細胞亞群監測結果表明，與對照組相比，呼吸道感染患兒體內CD3、CD4以及CD4+/CD8水平顯著降低，表明T淋巴細胞免疫功能降低。這是由于病毒侵入并感染宿主機體時，宿主免疫功能被削弱。因此，呼吸道感染患兒發生病毒感染后，其機體內體液免疫或細胞免疫功能紊亂，積極監測免疫功能指標可以降低臨床i復呼 i感染k生
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