發(fā)布時間：2020-03-21所屬分類：科技論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：目的探索在藥品對照品標化中色譜條件的影響因素。方法以2個待標化的對照品為例，采用HPLCDAD法對其純度進行預(yù)標化。結(jié)果在HPLC中色譜柱類型、流動相的比例、柱溫、流速、檢測波長對其純度檢查均有一定的影響。結(jié)論色譜條件的影響因素較多，在實際應(yīng)用
摘要：目的探索在藥品對照品標化中色譜條件的影響因素。方法以2個待標化的對照品為例，采用HPLC—DAD法對其純度進行預(yù)標化。結(jié)果在HPLC中色譜柱類型、流動相的比例、柱溫、流速、檢測波長對其純度檢查均有一定的影響。結(jié)論色譜條件的影響因素較多，在實際應(yīng)用中可綜合考慮。
關(guān)鍵詞：純度分析;對照品;高效液相色譜一二級管陣列檢測
化學(xué)對照品是在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)完全清楚的基礎(chǔ)上，專供物理和化學(xué)測試時用于與供試藥品進行對照的物質(zhì)，其純度適合于使用要求并且質(zhì)量均一的實物樣品[1]。在我國，對照品的精制及標化分裝均由中國食品藥品檢定研究院(原中國藥品生物制品檢定所，簡稱中檢所)承擔。2010年，我所參與了部分新版藥典用化學(xué)對照品的標化工作，除按《中國藥典》2010年版對待標對照品進行純度分析外，還需與美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國藥典(BP)、日本藥典(JP)等分析結(jié)果比較，分析各國藥典方法的結(jié)果差異性。本文以2個對照品為例，探討在對待標品進行純度檢查時色譜條件的影響因素。
1儀器與試藥
Waters2690—996二極管陣列檢測器，高效液相色譜系統(tǒng)(Waters公司)，AE-240電子天平(梅特勒公司)，ZF一1三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)。乙酰谷酰胺對照品(批號：100859)、環(huán)扁桃酯對照品(批號：101118～201001)(中國食品藥品檢定研究院)。甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。
2《中國藥典及其他各國藥典收載分析方法情況
將2個對照品在《中國藥典》及其他各國藥典收載情況進行檢索，分析方法收載情況見表1。
3對照品標化中對色譜峰的純度要求
對照品標定作業(yè)指導(dǎo)書明確指出：盡量采用《中國藥典》的液相或者氣相方法進行純度檢查，如果國外藥典的色譜系統(tǒng)與《中國藥典》不一致，也需同時考察。HPLC法采用PDA檢測器，采用面積歸一化法和主成分自身對照法，供試品濃度的確定，以0.1濃度信噪比大于10為基礎(chǔ)，對供試品溶液的主峰進行純度檢查，若不純，對色譜條件進行調(diào)整直到純度檢查通過;可見色譜條件的優(yōu)化程度直接關(guān)系到峰純度。
“峰純度”測試是將某個峰中的光譜與其峰頂點光譜進行比較，以確定該峰是否包含光譜不同的組分_2]。PDA可以獲得樣品的色譜圖及每個色譜組分的光譜圖，即提供三維光譜一色譜圖(3D-譜圖)。純峰與不純峰在Waters2690—996純度識別見圖1，純峰與不純峰的純度角度及純度閾值結(jié)果見表2。
4試驗
4.1乙酰谷酰胺HPIC純度標化過程的影響因素
4.1.1色譜柱的選擇
在對乙酰谷酰胺對照品標定中，采用3種不同廠家的色譜柱：LichrospherC18柱(4.6mm×250mm，5/~m)(漢邦科技);XBridge州C18柱(4.6ramx250mm，5gin)(廣州菲羅門);CapcellPAKC18柱(4.6mm×250mm，5/~m)(日本資生堂)。流動相：0.05mol·I2磷酸二氫鉀溶液(用1o磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.99)一甲醇(95：5)41;檢測波長：210nm;進樣體積：2OL;流速：1.0mL·min;柱溫：3O℃;DAD掃描波長：190～800nm;供試品溶液的濃度：lmg·mI;對照品溶液的濃度：1p.g·mI～。乙酰谷酰胺在不同廠家色譜柱的色譜圖見圖2。
從圖2可見LichrospherC18色譜柱(4.6ram×250mm，5/~m)(漢邦科技)峰形較好，但純度未通過(純度角度為4.532，純度閾值為0.349)，因此選擇LichrospherC18柱為該品種純度測試的色譜柱。
4.1.2流動相比例的凋節(jié)
色譜峰的保留時間較短，將流動相適當調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)將有機相調(diào)節(jié)到1時，色譜峰的保留時間為5min左右，說明乙酰谷酰胺峰對甲醇的敏感度不高，且峰純度未通過，可以從柱溫、流速、進樣量進行適量的調(diào)節(jié)。
4.1.3DAD掃描波長的選擇
掃描波長時發(fā)現(xiàn)甲醇的基質(zhì)影響較大，乙酰谷酰胺因為甲醇的截止波長為205nm，在設(shè)定DAD色譜峰純度角度均是純度閾值的10倍以上，純度未通過。為消除該影響，筆者將DAD掃描波長設(shè)定為205～800nm。
4.1.4柱溫、流速、進樣量的選擇
在試驗中，將柱溫適當降低，流速降低，色譜峰保留時間為llmin左右，峰純度角度為0.498，而純度閾值為0.358，純度未通過;在保證0.1對照溶液主峰的信噪比為17.3時，將進樣量調(diào)節(jié)至1oL，乙酰谷酰胺色譜峰純度角度為0.268，純度閾值為0.308，純度通過。
可見，在使色譜峰純度通過并滿足0.1對照溶液的色譜峰的信噪比為1O的基礎(chǔ)上，色譜柱類型、掃描波長范圍、流動相組成成分比例的變化、柱溫、流速、進樣量的選擇對色譜峰的純度有一定的影響。
4.2環(huán)扁桃酯有關(guān)物質(zhì)檢測波長的選擇
在對照品標化中，純度測定方法選用色譜法，如HPLC檢查采用二極管陣列檢測器檢測色譜峰純度，TLC檢查結(jié)果可作為HPLC檢查結(jié)果的參考引。
環(huán)扁桃酯對照品標化HPLC純度方法色譜條件：以CapcellPAKC18(4.6mm×250ram，5m)為色譜柱，乙腈一水(4：1)為流動相，檢測波長為228nm(方法與USP32一NF27相同)。HPLC純度檢測結(jié)果采用面積歸一化法，提取228nm的色譜圖所得的供試品溶液中總雜質(zhì)含量為0.20(為了檢驗數(shù)據(jù)的保密性，給出的數(shù)值是參考值)，其中最大雜質(zhì)的含量為0.2(為了檢驗數(shù)據(jù)的保密性，給出的數(shù)值是參考值)。
環(huán)扁桃酯TLC法檢查純度薄層色譜條件：硅膠GF嘲板為薄層板，正己烷一乙酸乙酯一冰醋酸(8：2：1，v/V)為展開劑，在紫外光燈(254nm)下檢視[6]。TIc純度檢測結(jié)果供試品顯1個雜質(zhì)斑點，其大小、顏色與4對照溶液相當(為了檢驗數(shù)據(jù)的保密性，給出的數(shù)值是參考值)。
雜質(zhì)檢測結(jié)果采用不同的色譜方法，結(jié)果差異比較大。分析原因：主要是雜質(zhì)的檢測波長的選擇導(dǎo)致結(jié)果的差異性。在HPLC純化中，將檢測波長設(shè)定為254nm，采用面積歸一化法，供試品溶液中總雜質(zhì)含量為4.34(為了檢驗數(shù)據(jù)的保密性，給出的數(shù)值是參考值)，其中最大雜質(zhì)的含量為4.1%(為了檢驗數(shù)據(jù)的保密性，給出的數(shù)值是參考值)，且該雜質(zhì)在254nm的波長處有最大吸收。結(jié)果與TLC檢測結(jié)果不謀而合。筆者提取228nm波長處環(huán)扁桃酯及雜質(zhì)的吸收情況，根據(jù)其響應(yīng)因子，確定228nm為環(huán)扁桃酯的有關(guān)物質(zhì)的檢測波長。可見檢測波長的選擇在HPLC有關(guān)物質(zhì)檢測中的重要性。
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5討論
筆者在對乙酰谷酰胺HPLC純度標化試驗中發(fā)現(xiàn)：首先，色譜柱的類型、填料的性質(zhì)及封尾情況對色譜峰的峰形有很大的影響;其次，考慮到溶劑的截止波長，調(diào)節(jié)DAD掃描波長范圍;再次，考慮流動相的組成成分比例的變化、柱溫、流速、進樣量的選擇。可見在色譜峰的純度檢測中影響因素較多，建議要綜合考慮這些影響因素。
在HPLC法進行含量測定或者TLC鑒別時，為提高方法的靈敏度，降低干擾，往往選用主成分的最大吸收波長作為檢測波長，由于有關(guān)物質(zhì)檢查的對象是雜質(zhì)，若將主藥的最大吸收波長確定為檢測波長，則雜質(zhì)在此波長下的吸收可能偏低，某些雜質(zhì)甚至無吸收，這樣會造成對雜質(zhì)含量的低估甚至漏檢，從而不能反映產(chǎn)品的真實質(zhì)量，影響了對品種質(zhì)量可控性及穩(wěn)定性的評價。
