發(fā)布時間：2021-10-15所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：提出一種結(jié)合顯微鏡和微流控芯片技術(shù)的紅細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)分析方法，實現(xiàn)了紅細(xì)胞的動態(tài)顯微成像，用于紅細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)的測量與分析。利用微流控芯片的縮/擴(kuò)結(jié)構(gòu)使紅細(xì)胞在特定位置產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn);利用MATLAB對采集到的視頻圖像進(jìn)行分幀處理，通過
摘要：提出一種結(jié)合顯微鏡和微流控芯片技術(shù)的紅細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)分析方法，實現(xiàn)了紅細(xì)胞的動態(tài)顯微成像，用于紅細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)的測量與分析。利用微流控芯片的縮/擴(kuò)結(jié)構(gòu)使紅細(xì)胞在特定位置產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn);利用MATLAB對采集到的視頻圖像進(jìn)行分幀處理，通過灰度調(diào)整、中值濾波、形態(tài)學(xué)處理、質(zhì)心法、目標(biāo)物識別、動態(tài)跟蹤等算法處理后，實現(xiàn)對血細(xì)胞的有效識別與準(zhǔn)確的分類、計數(shù);對分類結(jié)果進(jìn)行多角度形態(tài)學(xué)分析，并對不同形態(tài)紅細(xì)胞進(jìn)行最大直徑的測量。通過對單細(xì)胞多幀關(guān)聯(lián)圖像的分析，驗證方法的準(zhǔn)確性;并利用紅細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)分析方法，對糖尿病患者血液及正常人血液進(jìn)行實驗。結(jié)果表明，糖尿病患者紅細(xì)胞相比于正常人紅細(xì)胞，其平均最大直徑及分布寬度均增大。微流控芯片結(jié)合圖像處理的方法可以實現(xiàn)糖尿病患者與正常人紅細(xì)胞高通量檢測及多角度分析，為其他類型樣本細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)測量提供新方法。
關(guān)鍵詞：微流控芯片;動態(tài)顯微成像;多角度形態(tài)學(xué)分析;紅細(xì)胞分布寬度
0引言
紅細(xì)胞(RedBloodCells，RBCs)也稱紅血球，是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，具有攜帶氧氣，輸送二氧化碳，維持血流結(jié)構(gòu)等諸多功能，并參與機體免疫調(diào)控的自我調(diào)節(jié)，在人體血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[1-4]。通常情況下，成熟的紅細(xì)胞呈雙凹圓盤狀[2]，其表面積和體積之比較大，有利于進(jìn)行氣體交換和自身變形。如果紅細(xì)胞形態(tài)異常，其形態(tài)及體積將發(fā)生改變，常見的異常紅細(xì)胞形態(tài)有水滴形、球形、橢圓形、鐮刀形、半月形等[5]。因此，紅細(xì)胞形態(tài)的變化，某種意義上決定著人體的健康狀況，是診斷很多疾病的重要指標(biāo)之一。
傳統(tǒng)的檢測血液細(xì)胞的儀器大多基于Coulter原理，對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行間接檢測[6，7]。這種方法存在一定的缺陷，當(dāng)檢測交叉細(xì)胞時，其信號會產(chǎn)生疊加現(xiàn)象，通常對糖尿病患者紅細(xì)胞粘連及血小板聚集現(xiàn)象產(chǎn)生誤差。為了克服這一缺點，需要對細(xì)胞進(jìn)行直接的形態(tài)學(xué)測量，醫(yī)院里常用的方法是人工血涂片鏡檢法，此方法是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，可以通過顯微鏡對血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行靜態(tài)分析，對各種血液病的診斷有很大的價值[8，9]。但血片制備和染色不良，常使細(xì)胞鑒別發(fā)生困難，甚至導(dǎo)致錯誤結(jié)論，另外，此方法只能對異常細(xì)胞進(jìn)行單一角度的檢測，無法實現(xiàn)對大樣本量、多角度的檢測[10]，不僅費時，而且效率和精度都很低。為了實現(xiàn)對大樣本量的檢測，微流控芯片在生物醫(yī)學(xué)研究中顯示出巨大潛力，以微流控技術(shù)為基礎(chǔ)的圖像細(xì)胞分析法開始流行起來。該方法成本低，不需要復(fù)雜的樣品制備，而且能夠提供細(xì)胞形態(tài)的可視化信息，實現(xiàn)了對大樣本量的檢測。
因此，本文通過顯微鏡結(jié)合微流控芯片的方法，提出了動態(tài)顯微成像技術(shù)對紅細(xì)胞多角度形態(tài)分析的方法。這種方法不僅可以實現(xiàn)對紅細(xì)胞大樣本量、高分辨率的檢測，同時利用細(xì)胞跟蹤技術(shù)，對紅細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確識別，實現(xiàn)對紅細(xì)胞多角度的形態(tài)學(xué)分析。
1動態(tài)顯微成像原理
為了獲取紅細(xì)胞在特定位置不同角度的形態(tài)，需要設(shè)計特定的通道結(jié)構(gòu)，并利用顯微鏡對紅細(xì)胞在通道中的流動狀態(tài)進(jìn)行采集，通過動態(tài)圖像處理方法對采集到的視頻圖像進(jìn)行處理，進(jìn)而實現(xiàn)對紅細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)的分析。
1.1單細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)獲取
紅細(xì)胞在通道中流動時，發(fā)生的旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)是隨機的、不確定的，另外，微流控芯片通道結(jié)構(gòu)設(shè)計的不同，它的作用和效果也不盡相同[11-13]。為了使紅細(xì)胞在特定位置旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)，得到其不同角度的形態(tài)，本文將微流控芯片通道結(jié)構(gòu)設(shè)計成進(jìn)樣口多彎曲結(jié)構(gòu)與成像區(qū)域凹凸結(jié)構(gòu)相結(jié)合的整體通道結(jié)構(gòu)。
由于細(xì)胞的聚集性與黏附性，細(xì)胞在流體中流動時，會產(chǎn)生聚集成一團(tuán)的現(xiàn)象，使成像區(qū)域不能更好的觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，造成細(xì)胞的誤識別。為了減少細(xì)胞聚集，將成團(tuán)細(xì)胞順序排列，在成像區(qū)域能夠呈現(xiàn)出一排排的單細(xì)胞，在進(jìn)樣口增加了多彎曲結(jié)構(gòu)。另外，由于紅細(xì)胞特殊的雙凹圓盤結(jié)構(gòu)，在流體中流動時，紅細(xì)胞會出現(xiàn)隨機的、多角度的傾斜、翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)等現(xiàn)象。為了解決紅細(xì)胞隨機旋轉(zhuǎn)/翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象，本文將成像區(qū)域通道結(jié)構(gòu)設(shè)計成縮/擴(kuò)結(jié)構(gòu)，有效改變了流道內(nèi)速度分布情況，實現(xiàn)了細(xì)胞在特定位置的翻轉(zhuǎn)/旋轉(zhuǎn)，增加了紅細(xì)胞的不同形態(tài)特征，從而實現(xiàn)對紅細(xì)胞更準(zhǔn)確的識別與分析。
利用上述的通道結(jié)構(gòu)，使紅細(xì)胞在特定位置發(fā)生旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)，利用所呈現(xiàn)出來的不同角度的形態(tài)，對其形態(tài)參數(shù)進(jìn)行測量。為了得到紅細(xì)胞更為準(zhǔn)確的最大直徑，對單細(xì)胞的每一幀形態(tài)進(jìn)行測量，計算其在此形態(tài)時的直徑D，并將此單細(xì)胞所有形態(tài)下測得的直徑(D1、D2、D3、…)進(jìn)行比較，得到其最大直徑。細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)最大直徑獲取示意圖如圖1所示。
1.2單細(xì)胞多幀圖像關(guān)聯(lián)分析
基于圖像法的微流控芯片紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析通常涉及圖像預(yù)處理、目標(biāo)檢測、目標(biāo)跟蹤三個主要部分[14-16]。整體流程圖如圖2所示。(1)圖像預(yù)處理：將視頻圖像拆分為單幀灰度圖像，采取分量法對原始圖像進(jìn)行灰度化，選擇圖像清晰且背景噪音小的范圍作為研究對象。為了消除圖像噪聲，改善圖像質(zhì)量，本文采用3×3中值濾波對區(qū)域圖像進(jìn)行處理，最后，設(shè)置合適的閾值對灰度圖像進(jìn)行二值化處理[17-19]。(2)目標(biāo)檢測：在二值化圖像中，對目標(biāo)物進(jìn)行檢測與識別，利用質(zhì)心法標(biāo)記出所需要分析的目標(biāo)物。首先，利用imclearborder函數(shù)將通道背景和在實驗視野范圍邊緣的不完整的細(xì)胞進(jìn)行清除，減小圖像識別過程中的干擾;再利用連通域與面積判斷的方法，將大于一定面積的細(xì)胞(紅、白細(xì)胞)識別出來，剔除掉血小板，從而實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測與識別[17-18]。另外，需要對目標(biāo)物體的橫、縱坐標(biāo)進(jìn)行計算，標(biāo)記其當(dāng)前幀的質(zhì)心位置。在此過程中，只對大于一定面積的目標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)心標(biāo)記，并建立當(dāng)前幀橫、縱坐標(biāo)數(shù)據(jù)集X1、Y1。(3)目標(biāo)跟蹤：在下一幀目標(biāo)物的識別中，利用相同的檢測方法，對當(dāng)前幀目標(biāo)物進(jìn)行檢測，并建立當(dāng)前幀質(zhì)心點坐標(biāo)集X2、Y2。根據(jù)細(xì)胞位移特點，分別為當(dāng)前幀每一個目標(biāo)物進(jìn)行前幀匹配，建立幀與幀之間的數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，并繪制其運動軌跡跟蹤曲線，最后將當(dāng)前幀目標(biāo)質(zhì)心點坐標(biāo)集X2、Y2作為下一幀匹配的坐標(biāo)集X1、Y1。(4)細(xì)胞分類、計數(shù)：對單細(xì)胞多幀跟蹤結(jié)果進(jìn)行分析，利用紅、白細(xì)胞特征進(jìn)行判斷，進(jìn)而實現(xiàn)對紅、白細(xì)胞的分類、計數(shù)。最后，對分類結(jié)果的紅細(xì)胞多幀關(guān)聯(lián)的灰度圖像進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。
2實驗與結(jié)果分析
2.1實驗系統(tǒng)搭建
實驗系統(tǒng)主要包括氣路系統(tǒng)、微流控芯片、顯微成像三個部分。氣路系統(tǒng)主要由壓力泵和調(diào)節(jié)閥組成，用來控制樣品的進(jìn)液速度，使全血細(xì)胞順利的通過微流道，并可以在顯微鏡中清晰成像。用壓力調(diào)節(jié)器調(diào)制進(jìn)液樣品的流速，其壓力值大小可由壓力表測量。微流控芯片結(jié)構(gòu)方面，利用進(jìn)樣口多彎曲結(jié)構(gòu)與成像區(qū)域凹凸結(jié)構(gòu)相結(jié)合的整體通道結(jié)構(gòu)設(shè)計芯片結(jié)構(gòu)，并將縮/擴(kuò)的凹凸結(jié)構(gòu)作為成像區(qū)域，對血細(xì)胞成像效果進(jìn)行驗證。圖3(a)為實驗系統(tǒng)圖，圖3(b)為微流控芯片實物圖，圖3(c)為所涉及的微流道結(jié)構(gòu)示意圖，圖3(d)為圖3(c)虛線矩形框通道結(jié)構(gòu)尺寸放大圖及流體流動方向。
2.2單細(xì)胞多角度形態(tài)分析結(jié)果
為了驗證本文基于動態(tài)顯微成像對紅細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)分析的準(zhǔn)確性，利用人血細(xì)胞對紅、白細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，并進(jìn)行準(zhǔn)確的分類與計數(shù)。取5μL的健康人血細(xì)胞加入1mL的PBS溶液中，充分混勻，將其作為實驗的樣本溶液。取少量溶液加入微流控芯片儲液池中，通過調(diào)節(jié)壓力泵調(diào)節(jié)閥控制樣本溶液的流速，利用顯微鏡觀察微流控芯片的成像區(qū)域，記錄細(xì)胞通過通道的全過程。
基于以上圖像處理方法對實驗視頻進(jìn)行分析，對識別、跟蹤到的細(xì)胞(紅、白細(xì)胞)，在視野范圍內(nèi)運動結(jié)束時，對其運動軌跡所有形態(tài)進(jìn)行分析，利用紅細(xì)胞的雙圓環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行判斷與區(qū)分。對88000幀圖像進(jìn)行處理，根據(jù)結(jié)果可知，當(dāng)紅細(xì)胞平行于通道時，圖像處理可得到雙圓環(huán)結(jié)構(gòu)(紅細(xì)胞特定結(jié)構(gòu))，將單細(xì)胞跟蹤到的所有形態(tài)進(jìn)行分析，如有一幀為雙圓環(huán)結(jié)構(gòu)，可把它定義為紅細(xì)胞，進(jìn)而實現(xiàn)紅、白細(xì)胞的區(qū)分。紅細(xì)胞圖像處理目標(biāo)跟蹤運動軌跡圖如圖4所示。同上述紅細(xì)胞圖像處理相同，圖5為白細(xì)胞運動跟蹤軌跡圖。
根據(jù)1.2節(jié)所描述的處理步驟，對實驗記錄的視頻進(jìn)行處理。通過質(zhì)心定位法建立數(shù)據(jù)坐標(biāo)集，利用位移判斷細(xì)胞上幀位置，建立幀與幀之間的相關(guān)聯(lián)并繪制其運動軌跡跟蹤曲線。計數(shù)結(jié)果顯示，檢測出紅細(xì)胞數(shù)量為11270個，白細(xì)胞數(shù)量為11個。紅、白細(xì)胞比例約為1000∶1，此方法可實現(xiàn)對紅、白細(xì)胞的準(zhǔn)確識別與計數(shù)。
2.3紅細(xì)胞直徑測量與統(tǒng)計分析
為了驗證微流控結(jié)合顯微鏡對細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)分析的可行性，實驗分別對糖尿病患者和正常人進(jìn)行血液采集，并對兩組血液進(jìn)行相同濃度(200：1)配置，分析糖尿病患者紅細(xì)胞與正常人紅細(xì)胞形態(tài)大小的差異[20]。在進(jìn)行直徑標(biāo)定前對細(xì)胞做旋轉(zhuǎn)處理，即將細(xì)胞“擺正”，此時細(xì)胞質(zhì)心的橫、縱坐標(biāo)處將會產(chǎn)生最大直徑，如圖6(a)所示。利用跟蹤、識別對檢測出的紅細(xì)胞進(jìn)行測量，分析每一個紅細(xì)胞在視野范圍內(nèi)的不同形態(tài)，對其所有形態(tài)的最大直徑進(jìn)行檢測，利用其質(zhì)心坐標(biāo)點的灰度二維曲線反值圖的峰值寬度進(jìn)行標(biāo)定，對比得到其最大直徑。
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對跟蹤、識別出的紅細(xì)胞進(jìn)行測量，利用其質(zhì)心位置的坐標(biāo)點，繪制其灰度二維曲線圖，如圖6所示。對每一段視頻隨機選取十幀圖像，經(jīng)過對通道中實際尺寸已知的“十”字結(jié)構(gòu)與其灰度二維曲線反值圖的峰值寬度對比，得到紅細(xì)胞直徑灰度二維曲線反值圖的峰值寬度與實際尺寸有固定比例。得到其灰度二維曲線反值圖的峰值寬度與實際尺寸有固定比例，因此，在后續(xù)對紅細(xì)胞不同形態(tài)的測量中，統(tǒng)一對其灰度曲線反值圖的峰值寬度進(jìn)行測量，并據(jù)此計算紅細(xì)胞相對直徑。
圖像處理所計算出來的最大直徑為像素點，為了避免視頻拍攝過程中放大尺寸所造成的誤差，利用通道中的固定尺寸參數(shù)進(jìn)行比例換算，得到與實際情況相匹配的數(shù)值。正常紅細(xì)胞與糖尿病患者紅細(xì)胞最大直徑分布如圖7所示。
此實驗統(tǒng)計中，正常人紅細(xì)胞統(tǒng)計個數(shù)為10003個，平均最大直徑約為7.886μm，標(biāo)準(zhǔn)差為0.761;糖尿病患者紅細(xì)胞統(tǒng)計個數(shù)為10001個，平均最大直徑約為10.026μm，標(biāo)準(zhǔn)差為1.837。統(tǒng)計結(jié)果在數(shù)值上均有增大，另外，統(tǒng)計圖可以直觀地看出，糖尿病患者具有更大的最大直徑分布寬度，正常人紅細(xì)胞最大直徑分布寬度大約為5～9.5μm，糖尿病患者最大直徑分布寬度大約為5.5～14μm。
3結(jié)論
顯微鏡結(jié)合微流控芯片技術(shù)，通過圖像處理的方法，實現(xiàn)了對紅、白細(xì)胞準(zhǔn)確的分類、計數(shù)，通過對紅細(xì)胞多角度形態(tài)學(xué)的分析，可準(zhǔn)確測量紅細(xì)胞的最大直徑。為了驗證該方法的可行性，分別對糖尿病患者和正常人紅細(xì)胞進(jìn)行實驗和分析。正常人紅細(xì)胞最大直徑分布寬度大約為5～9.5μm，糖尿病患者約為5.5～14μm，糖尿病患者紅細(xì)胞相比于正常紅細(xì)胞最大直徑會增大。實驗結(jié)果測得，正常人紅細(xì)胞平均最大直徑約為7.886μm，糖尿病患者約為10.026μm，此方法可獲得紅細(xì)胞的最大直徑;另外，糖尿病患者紅細(xì)胞最大直徑分布寬度比正常紅細(xì)胞最大直徑分布寬度更大。此方法實現(xiàn)了對血細(xì)胞大樣本量、高分辨率的檢測，可對紅細(xì)胞多角度的不同形態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確識別，從而得到更準(zhǔn)確的紅細(xì)胞最大直徑，為紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析提供方法。——論文作者：張朦，孟曉辰*，祝連慶
