發(fā)布時(shí)間：2021-09-27所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：目的建立不同中藥中蛇床子素的含量測(cè)定方法。方法采用AgilentZORBAXSBC18色譜柱(250mm4.6mm，5m)，流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液(體積比70:30)，流速為1.0mLmin-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為322nm，柱溫30℃。結(jié)果蛇床子素在質(zhì)量濃度為0.100～1.90gL-1內(nèi)與峰面
摘要：目的建立不同中藥中蛇床子素的含量測(cè)定方法。方法采用AgilentZORBAXSBC18色譜柱(250mm×4.6mm，5µm)，流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液(體積比70:30)，流速為1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為322nm，柱溫30℃。結(jié)果蛇床子素在質(zhì)量濃度為0.100～1.90g·L-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為0.36%、0.28%、0.45%，均符合要求。高、中、低平均加樣回收率分別為98.35%、100.78%、101.4%。蛇床子、菟絲子、獨(dú)活、白芷、白前等中藥材中蛇床子素的含量分別為7.74、0.0230、7.42、0.0419、4.43mg·g-1。結(jié)論建立的高效液相色譜法方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，快速，重復(fù)性好，專屬性好，可應(yīng)用于不同中藥中蛇床子素的含量測(cè)定。
關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;蛇床子素;含量測(cè)定;外標(biāo)法
蛇床子、獨(dú)活等中藥材均含有蛇床子素的成分[1-2]，蛇床子素是香豆素類成分中最主要藥效成分，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)，保護(hù)神經(jīng)，抗骨質(zhì)疏松，保護(hù)心血管，保護(hù)腎臟的功效，在現(xiàn)代藥理學(xué)中的作用尤為顯著[3]。
1儀器與材料
Waterse2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，KQ-500E型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)R224CN型電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)，凱特離心機(jī)(鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，GM0.33A隔膜真空泵(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)
甲醇(美國(guó)天地高純?nèi)軇┯邢薰?，水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，蛇床子素對(duì)照品(批號(hào)17080510，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.81%)。
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蛇床子[Cnidiummonnieri(L.)Cuss]、獨(dú)活(AngelicapubescensMaxim.f.biserrataShanetYuan)、白芷[Angelicadahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.exFranch.etSav]等藥店購(gòu)買，產(chǎn)地四川，菟絲子(CuscutachinensisLam.)、白前[Cynanchumstauntonii(Decne.)Schltr.exLevl]等藥店購(gòu)買，產(chǎn)地安徽。以上中藥均由山東第一醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)教研室曲曉蘭副教授鑒定均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版(一部)項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。
2方法與結(jié)果
2.1溶液的制備
2.1.1供試品溶液的制備
將適量蛇床子藥材于研缽內(nèi)研磨成粉末，稱取5g置于50mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲處理30min，室溫冷卻，甲醇補(bǔ)足至刻度，靜置片刻，于3000r·min-1離心5min，將上清液經(jīng)0.45µm微孔濾膜濾過，濾去初濾液2.0～3.0mL，取續(xù)濾液即得，備用。
2.1.2對(duì)照品溶液的制備
取蛇床子素對(duì)照品適量，加甲醇定容至25mL棕色量瓶中，搖勻，制得質(zhì)量濃度為2.016g·L-1的蛇床子素儲(chǔ)備液。
2.2色譜條件
色譜柱為AglientC18柱(250mm×4.6mm，5µm)，流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸(體積比70:30)。檢測(cè)波長(zhǎng)為322nm，流速為1.0mL·min-1，進(jìn)樣量為10µL，柱溫為30℃[4]。
2.3方法學(xué)考察
2.3.1專屬性試驗(yàn)
分別將甲醇(溶劑)、蛇床子素對(duì)照品溶液、蛇床子供試品溶液，按照“2.2”條色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得色譜圖。由圖1可知，蛇床子素的保留時(shí)間為11.9min。供試品溶液主峰的保留時(shí)間與蛇床子素對(duì)照品的色譜峰保留時(shí)間一致。以蛇床子素色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)為1600，與相鄰組分分離較好。
2.3.2線性與范圍
分別精密量取蛇床子素對(duì)照品儲(chǔ)備液0.496、2.73、4.96、7.19和9.43mL置10mL量瓶?jī)?nèi)，并用甲醇定容至刻度，搖晃均勻，即可得到質(zhì)量濃度為0.100、0.550、1.00、1.45和1.90g·L-1的蛇床子素對(duì)照品溶液，按“2.2”條色譜條件各質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣3次，取平均值，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(ρ，g·L-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。所得回歸方程為：A=3.0×107ρ-3.0×105，r=0.9992。結(jié)果表明，蛇床子素在質(zhì)量濃度為0.100～1.90g·L-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。
2.3.3精密度試驗(yàn)
取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2”條色譜條件，進(jìn)樣量為10µL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，記錄蛇床子素的峰面積。計(jì)算蛇床子素的RSD為0.36%，小于3.0%，表明該方法的精密度良好。
2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)
按“2.1.1”項(xiàng)下方法新配制蛇床子供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、10、12h等不同時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)樣，記錄蛇床子素的峰面積。計(jì)算蛇床子素RSD為0.45%，小于3.0%，結(jié)果表明本蛇床子供試品溶液在12h內(nèi)保持穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。
2.3.5重復(fù)性試驗(yàn)
取蛇床子粉末6份，分別按“2.1.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法配制溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄蛇床子素的峰面積。計(jì)算蛇床子素的RSD為0.28%，小于3.0%，重復(fù)性良好。
2.3.6加樣回收率試驗(yàn)
按“2.1.1”項(xiàng)下方法配制蛇床子溶液3份，分別按80%、100%、120%高中低3個(gè)不同質(zhì)量濃度精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液加入其中，甲醇定容至刻度，搖晃均勻，精密量取1mL于進(jìn)樣瓶進(jìn)樣，進(jìn)樣量10µL，每種質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次。每份按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別記錄其色譜圖峰面積。結(jié)果見表1。
2.3.7樣品含量測(cè)定
取菟絲子、獨(dú)活、白芷、白前等中藥藥材，分別將其置于研缽內(nèi)研成細(xì)粉，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試溶液，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件取3份進(jìn)行測(cè)定[5]，結(jié)果見表2。
3討論
通過在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)高效液相色譜條件的不斷優(yōu)化，使蛇床子素的出峰時(shí)間和分離效果較好，本實(shí)驗(yàn)首先通過對(duì)蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，進(jìn)行梯度洗脫以確定試驗(yàn)中流動(dòng)相的大體比例，后采用等度洗脫對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)一步選擇最適合于該試驗(yàn)的流動(dòng)相比例，來達(dá)到優(yōu)化的目的，使實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更加的可靠。
實(shí)驗(yàn)中以甲醇作為有機(jī)相，調(diào)試水相來使色譜峰分的更好，分別嘗試不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸、冰醋酸、磷酸等不同流動(dòng)相作為該實(shí)驗(yàn)的水相[6-7]，進(jìn)樣蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，從色譜圖比較來看，當(dāng)水相為0.05%磷酸水溶液的時(shí)候，色譜圖中蛇床子素的所出的峰更加穩(wěn)定分離效果更好，與其他峰的干擾小。
關(guān)于蛇床子、獨(dú)活等中藥中蛇床子素的提取：《中華人民共和國(guó)藥典》2015版(一部)均是采用無水乙醇溶解、超聲處理[8]，其提取方法簡(jiǎn)便、快速，但無水乙醇極易揮發(fā)，導(dǎo)致所配制的溶液濃度極不穩(wěn)定，導(dǎo)致耗時(shí)、耗材。有文獻(xiàn)采用薄層色譜法測(cè)蛇床子素的含量[9]，手動(dòng)操作比較多，人為的影響因素大，重現(xiàn)性不好。本實(shí)驗(yàn)在查閱以及研究文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用甲醇溶解、超聲，提取方法同于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版，提取效果相似，配制的溶液較為穩(wěn)定。通過e2695高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定、消除人為因素，且方法簡(jiǎn)便快捷，重現(xiàn)性較好。——論文作者：趙新紅，張作華，范珊，侯雪芹，齊永秀*，李珂*
