發布時間：2020-04-10所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： [摘要]目的：觀察胰高血糖素樣肽一1(GLP一1)對大鼠心肌缺血再灌注/細胞缺氧復氧損傷的作用并探討其機制。方法：建立大鼠缺血再灌注模型，分別設假手術組(sham)、缺血再灌注組(IR)和IR+GLP一1(0.030nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmol/L)組，缺血30min后再灌注3h，
[摘要]目的：觀察胰高血糖素樣肽一1(GLP一1)對大鼠心肌缺血再灌注/細胞缺氧復氧損傷的作用并探討其機制。方法：建立大鼠缺血再灌注模型，分別設假手術組(sham)、缺血再灌注組(IR)和IR+GLP一1(0.030nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmol/L)組，缺血30min后再灌注3h，Evan'sblue—TYC法檢測心肌梗死范圍;取左心室游離壁心肌組織，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，同時測定心肌組織中氧化一抗氧化物質超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;培養乳鼠心肌細胞，隨機分為正常對照組(contro1)、單純缺氧復氧組(HR)、HR+GLP一1(1~mol/L、5bcmol/L和10txmol/L)組，電鏡下觀察心肌細胞形態的變化，流式細胞術檢測心肌細胞的凋亡，測定乳酸脫氫酶(LDH)釋放、SOD活性、MDA含量、活性氧簇(ROS)水平以及線粒體膜電位(MMP)。結果：與IR組相比，IR+GLP一1(0.03nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmolfL)組劑量依賴性地減小心肌梗死面積，減輕線粒體超微結構改變及細胞凋亡，增加SOD活性，減少MDA含量(P<0.05或P<0.01);與HR組相比，HR+GLP一1(1t~mol/L、5I~mol/L和10p~moL/L)組劑量依賴性地逆轉HR誘導的細胞損傷，增加SOD活性，減少MDA含量，降低ROS水平，減輕HR誘導的MMP降低(P<0.05或P<0.01)。結論：GLP一1可以減輕大鼠心肌缺血再灌注/細胞缺氧復氧損傷;其作用機制可能與增強心肌抗氧化能力及保護線粒體結構和功能有關。
[關鍵詞]胰高血糖素樣肽一1;缺血再灌注損傷;缺氧復氧;心肌細胞;抗氧化;線粒體膜電位
胰高血糖素樣肽一l(glucagon—likepeptide一1，GLP一1)又稱為腸促胰島素、類胰升血糖素一1或胰升血糖素樣肽一1。人們對GLP一1的研究多集中于它在糖尿病的發生、發展以及治療領域的作用上，新近國外研究提出GLP一1對心肌損傷具有一定的保護作用。Nikolaidis等研究發現給予擴張性心肌病狗GLP一1后，心肌細胞對葡萄糖的攝取和左心室的收縮功能均有明顯的改善。此外對心肌梗死病人給予GLP一1也可以改善患者的心功能以及血管成形術后嚴重的左心室收縮功能不良J。心肌缺血/再灌注損傷(myocardialischemia—reperfusioninjury，MIRI)是臨床上最為常見的損傷心肌的病理生理過程之一_3J。但是目前國內關于GLP一1對心肌缺血再灌注損傷作用的研究還相對較少，其相關機制仍尚未闡明。
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本實驗以在體大鼠和體外培養乳鼠心肌細胞為模型，觀察GPL一1對心肌細胞損傷的影響，并初步探討其作用機制，為心肌缺血再灌注損傷的治療提供新的線索和思路。
材料和方法
1主要儀器和試劑
健康雄性Sprague—Dawley(so)大鼠及1—3日齡SD乳鼠均由山西醫科大學實驗動物中心提供。胰高血糖素樣肽一1(Sigma);兔抗鼠Ot一肌動蛋白I抗(北京博奧森);RBITC一羊抗兔Ⅱ抗(solarbio，Spain);超氧化物歧化酶(supemxidedismutase，SOD)測試盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);膜聯蛋白V一異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV—FITC/PI)雙染色試劑盒(晶美生物工程有限公司);細胞凋亡原位檢測試劑盒(Roche);二氯熒光素二乙酯(DCF—DA，Sigma);線粒體膜電位檢測試劑(Jc一1，凱基生物科技發展有限公司)。倒置顯微鏡(NikonTS100);動物人工呼吸機(成都泰盟科技有限公司，HX一100E);多道生理信號采集處理系統(RM6240BD，成都儀器廠);激光掃描共焦顯微鏡(OlympusFV1000);透射電鏡(JEM—CX100)。
2缺血再灌注模型建立
戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定。記錄Ⅱ導聯心電圖，氣管插管，小動物呼吸機輔助呼吸，經胸骨左緣第2—3肋間打開胸腔暴露心臟，于左心耳根部下方2mm處用5/o線結扎冠狀動脈前降支，將絲線兩端·859·穿過1根聚乙烯小管，止血鉗夾持細管，結扎線以下心肌組織顏色變暗，在Ⅱ導聯心電圖見R波明顯增大伴sT段即刻抬高，說明心肌已缺血。30min后予以再灌注，以缺血區轉紅，相關導聯sT段明顯回落為再通標志，并持續3h。
3乳鼠心肌細胞的培養
取1～3d齡SD大鼠，雌雄不限，開胸取心室肌作原代細胞培養，差速貼壁法分離純化心肌細胞，48h后更換培養基。培養3—4d后，倒置顯微鏡下觀察細胞自發搏動情況。針對胞漿中0【一actin，采用抗一actinI抗與FITC標記的熒光Ⅱ抗，免疫熒光法鑒定心肌細胞。
4心肌細胞缺氧/復氧模型的建立
采用Koyama等的方法，配制缺氧液和復氧液。缺氧液(NaH2PO40.9mmol/L，NaHCO36.0mmol/L，CaC121.0mmol/L，MgSO41.2mmol/L，乳酸鈉40mmol/L，HEPES20mmol/L，NaC198.5mmol/L，KC110.0mmol/L，pH6.8，37℃)，預先用高濃度氮氣飽和(>99.9%，1L/min×30min)，測血氣PO2≤4.0kPa;復氧液(NaH2PO40.9mmol/L，NaHCO320mmol/L，CaC121.0mmol/L，MgSO41.2mmol/L，葡萄糖5.5mmol/L，HEPES20mmol/L，NaC1129.5mmol/L，KC15.0mmol/L，pH7.4，37oC)，預先用純氧飽和(1L/rain×30min)。實驗時棄去原培養液，用缺氧液漂洗細胞2次，換預先經高濃度N飽和的缺氧液，培養板置純N持續通氣的密閉容器中(37℃)3h，再換預先經純氧飽和的復氧液，以純0復氧孵育1h(37oC)。
5實驗分組
實驗動物隨機分為5組，每組16只。假手術組：穿線但不行冠脈結扎;IR組：開胸結扎冠狀動脈左前降支30min，松解結扎后再灌注3h;IR+GLP—l組：于缺血再灌注前30min經舌靜脈緩慢注入GLP一1(0.03nmol/L、0.16nmol/L和0.30nmol/L)，隨后處理同IR。
乳鼠心肌細胞培養3d后，給予缺氧復氧處理，實驗分為5組：正常對照組;HR組;HR+GLP一1(1~mol/L、5I~mol/L和10p,mol/L)組：GLP一1預孵育24h后給予缺氧復氧處理。
6心肌梗死面積的測定
大鼠經再灌注3h后再次原位結扎左冠狀動脈，經頸動脈注入伊文氏藍。取出心臟，切片，Trc染色，藍色為未缺血區域、紅色為缺血區域。將紅色的缺血心肌片置于TTC磷酸緩沖液染色。缺血但未梗死心肌染成紅色，梗死心肌則為灰白色，稱量缺血未梗死心肌和梗死心肌濕重。心肌缺血范圍=缺血心肌面積/左心室面積(areaatrisk/eftventriculararea，AAR/LV);心肌梗死范圍=壞死區面積/危險區面積(necroticarea/areaatrisk，NEC/AAR)
7心肌超微結構觀察
迅速取下心尖部心肌組織切成1mmx1mmx1mm，戊二醛磷酸鹽緩沖液、錢酸各固定2h，脫水、包埋、切片、醋酸雙氧鈾、枸檬酸雙重染色，透射電鏡下觀察心肌細胞超微結構。
8心肌細胞凋亡測定
采用TUNEL凋亡試劑盒檢測各組心肌組織中的凋亡細胞，激光掃描共焦顯微鏡下觀察，TUNEL陽性細胞核呈綠色熒光。
9流式細胞儀檢測心室肌細胞的凋亡率0.125%胰蛋白酶制備單細胞懸液，用AnnexinV-FTTC/P雙染色標記法進行流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
10心肌氧化、抗氧化物質檢測
再灌注3h結束后取左心室前壁心肌組織，-70℃冰箱凍存，制備組織勻漿，按試劑盒說明書操作檢測SOD活性和MDA含量。復氧1h后收集各組心室肌細胞培養液，按照乳酸脫氫酶(lactatedehy-drogenase，LDH)，MDA，SOD試劑盒的操作說明測定各實驗組心肌細胞培養液中LDH，MDA的含量及SOD活性。
11細胞內ROS含量檢測
心肌細胞內ROS產生水平通過使用ROS敏感的熒光探針DCF-DA測定。細胞爬片，給予相應處理后，DCF-DA染液37℃孵育30min，熒光顯微鏡下隨機采集5個不重復區。用Image」軟件進行熒光強度分析。
12線粒體膜電位檢測
收集細胞，加入JC-1溶液(10mg/L)，37℃，5%
co，培養箱孵育15min，清洗，重懸細胞，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞線粒體發射紅色熒光，同一濾光鏡下呈橙色，細胞凋亡時紅色熒光強度減弱，綠色熒光增強，同一濾光鏡下呈綠色。圖像結果用Image」軟件分析計算綠色和紅色熒光強度平均值，綠色與紅色熒光強度的比值代表心肌細胞去極化程度。
13統計學處理
用SPSS12.0統計軟件進行分析，數據以均數標準差(xts)表示，數據分析采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。結果
1心肌梗死面積
假手術組心肌缺血范圍為0，IR組與GLP-1+
IR組AAR/LV差異無顯著(P>0.05)，說明實驗操作手法基本一致，排除了由此而造成的誤差。與IR組此較，IR+GLP-1組NEC/AAR明顯下降(P<0.
05)，見表1。
2心肌細胞超微結構觀察
假手術組線粒體沿肌絲長軸排列整齊，外膜完整，暗密集，基質致密，內有電子致密顆粒。胞核呈橢園形，異染色質分布均勻。IR組出現廣泛的線粒體損傷，表現為線粒體腫脹，基質明顯變淡，嵴排列紊亂。核皺縮，染色質凝集。GLP-1預處理組除部分區域線粒體有改變外，與對照無明顯區別，見圖1.
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