發布時間：2020-03-20所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 【摘要】目的探討雙歧桿菌(Bifidobacterium，BIFI)對慢性酒精性肝損傷(chronicalcoholicliverinjury，CALI)大鼠肝功能的保護或影響作用，并初步探討其機制。方法將SD大鼠隨機分為CALI組，美他多辛(90mg/kg)組，BIFI低(500mg/kg)、中(1000mg/kg)、高(2000mg/k
【摘要】目的探討雙歧桿菌(Bifidobacterium，BIFI)對慢性酒精性肝損傷(chronicalcoholicliverinjury，CALI)大鼠肝功能的保護或影響作用，并初步探討其機制。方法將SD大鼠隨機分為CALI組，美他多辛(90mg/kg)組，BIFI低(500mg/kg)、中(1000mg/kg)、高(2000mg/kg)劑量組，沉默信息調節蛋白1(silentinformationregulatoryprotein1，SIRT1)抑制劑Tenovin-6(25mg/kg)組。CALI組及空白對照組給予等體積生理鹽水灌胃。8周后，分析各組大鼠肝功能;檢測肝組織和血清中TG、TC水平;蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織病理變化;蛋白印跡(WB)法分析肝組織中SIRT1、chREBP表達情況。結果與對照組比較，CALI組大鼠肝功能明顯下降，血液中ALT、AST水平明顯升高(P<0.05)，肝組織呈脂肪性病理損傷，肝組織和血清中TG、TC水平明顯升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達明顯降低(P<0.05)，chREBP蛋白表達明顯增高(P<0.05);與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠CALI組大鼠肝功能明顯增強，血液中ALT、AST水平明顯降低(P<0.05)，肝組織病理損傷明顯減輕，肝組織和血清中TG、TC水平明顯降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達明顯升高(P<0.05)，chREBP蛋白表達明顯降低(P<0.05)。以上效應均可被SIRT1特異性抑制劑Tenovin-6逆轉。結論BIFI可能通過調控SIRT1/ChREBP表達抑制脂質堆積，實現對慢性酒精性肝損傷大鼠的保護。
【關鍵詞】雙歧桿菌;慢性酒精性肝損傷;沉默信息調節蛋白1;碳水化合物結合蛋白
酒精依賴和濫用已成為目前我國甚至全球范圍內備受關注的健康問題，大量長期飲用含有酒精的飲料會導致肝發生脂肪肝等病理損傷，引起酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ALD)[1]。研究發現，腸道菌群可調節機體代謝脂質獲得能量的效率，參與機體飲食環境改變所致食物代謝活動的改變，調節血脂水平變化及脂肪在肝等的積累過程[2]。研究發現，沉默信息調節蛋白1(sirtuin-1，SIRT1)是一種組蛋白去乙�；福瑓⑴c調解能量代謝等過程[3];碳水化合物結合蛋白(carbohydrateelementbindingprotein，ChREBP)是肝中調控葡萄糖代謝的一種重要轉錄調節因子，可激活糖酵解過程和脂質合成相關基因的轉錄，在酒精性肝病發展過程中具有重要作用[4]。雙歧桿菌(Bifidobacterium，BIFI)作為人體腸道內的優勢菌群之一[5]，是否能通過調節脂質代謝影響酒精性肝疾病的發生發展尚不清楚。本研究通過構建慢性酒精性肝損傷(chronicalcoholicliverinjury，CALI)大鼠模型，旨在探討BIFI對CALI大鼠肝損傷的保護作用并初步探討其作用機制，為研究和開發防治酒精性肝損傷的治療方法提供新思路。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1實驗動物
70只清潔級SD大鼠，12周，體重180～210g，購自上海西普爾-必凱公司【SCXK(滬)2013-0016】。在廈門大學附屬第一醫院實驗動物中心統一進行常規飼養【SYXK(滬)-2013-0058】，均自由飲水飲食，1周后用于實驗。所有實驗均經本院動物實驗倫理委員會批準(倫理批準號:2014-03)。
1.1.2藥物、主要試劑與儀器
雙歧桿菌活菌膠囊(批號:S10960040)，購自麗江麗珠制藥廠;美他多辛膠囊(批號:H20092458)，購自浙江震元醫藥公司;SIRT1抑制劑Tenovin-6(批號:HY-15510)，購自美國MCE公司;無水乙醇(≥99.7%，批號:20140903)，購自碧云天生物公司;4%多聚甲醛、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色試劑盒、戊二醛、BCA試劑盒、DAB顯色試劑盒、蛋白提取試劑盒，購自上海生工生物技術公司;丙氨酸氨基轉移酶(alanineaminotransferase，ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartatetransaminase，AST)試劑盒，購自碧云天公司;Anti-SIRT1(批號:ab189494)、Anti-ChREBP(批號:ab81958)、Anti-GAPDH(批號:ab9548)，羊抗兔二抗(批號:ab6721)，購自美國ABCam公司;石蠟烤片機，購自德國Leica公司;普通光學顯微鏡，購自日本Olympus公司;蛋白電泳儀、半干轉膜儀，購自美國Bio-Rad公司等;全自動生化檢測儀，購自美國BC公司。
1.2方法
1.2.1動物造模及給藥
將70只SD大鼠隨機分成以下7組，每組10只:(1)空白對照組:空白+生理鹽水灌胃;(2)CALI組:酒精造模+生理鹽水灌胃;(3)陽性對照美他多辛(metadoxine，META)組:酒精造模+90mg/kgMETA灌胃給藥;(4)-(6)BIFI低、中、高劑量組:酒精造模+500mg/kgBIFI、1000mg/kgBIFI、2000mg/kgBIFI灌胃給藥;(7)Tenovin-6組:酒精造模+2000mg/kgBIFI+25mg/kgTenovin-6灌胃給藥，灌胃容積為10μL/g，每天1次，持續7d。按照Lieber-DeCarli方法進行酒精造模[6]，前6周分別給予5%酒精灌胃，后2周給予8%酒精灌胃。8周后，給予大鼠常規麻醉處理，取腹主動脈血5mL用于肝功能檢測;立即取出大鼠肝，洗凈后對稱切半，一半切碎后分成兩份，置于液氮中速凍，-80℃保存;一半置于4%多聚甲醛中固定，制備常規石蠟切片，用于HE染色和組織病理學觀察。
1.2.2生化指標檢測
(1)各組大鼠肝功能檢測:將1.2.1中血液標本靜置30min后，于3000r/min條件下離心10min，小心取出上層清液，一部分采用ALT試劑盒、AST試劑盒檢測血液中ALT水平和AST水平。
(2)血清三酰甘油(triglycerides，TG)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)水平檢測:將(1)中血清樣品置于全自動生化檢測儀中測定血清TG和TC的含量。
(3)肝組織TG和TC含量的測定:將1.2.1中冷凍大鼠肝組織取出，制備勻漿液，3000r/min條件下離心10min，采用ALT試劑盒、AST試劑盒檢測上清液中ALT水平和AST水平。
(4)肝組織病理形態變化觀察:對1.2.1中大鼠肝組織切片脫蠟、水化后，按照HE染色流程進行染色，中性膠封片，置于光學顯微鏡下，觀察大鼠肝組織形態。
(5)肝組織SIRT1、chREBP蛋白表達檢測:取出適量冷凍大鼠肝組織，在液氮中研磨，加入1.2mL蛋白裂解液，提取各組大鼠肝組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。經聚丙烯酰胺十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate，SDS)-凝膠電泳分離蛋白質，轉印至PVDF膜上;5%脫脂奶粉，封閉1h;分別加入一抗Anti-SIRT1、Anti-chREBP、Anti-GAPDH(1∶1000)，4℃孵育過夜;加入二抗(1∶5000)，室溫孵育1h�；瘜W發光法進行檢測，Tanon軟件拍攝圖像并進行分析。
1.3統計學方法
采用SPSS24.0軟件進行統計學分析，計量數據均采用平均數±標準差表示，行單因素方差分析。P<0.05，差異有統計學意義。
2結果
2.1BIFI對CALI大鼠肝功能的影響
與對照組比較，CALI組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯增高，差異有顯著性(P<0.05);與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯降低，差異有顯著性(P<0.05);與BIFI高劑量組比較，Tenovin-6組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯增高，見表1。
2.2BIFI對CALI大鼠脂質代謝的影響
與對照組比較，CALI組大鼠肝組織和血清中TG、TC含量明顯增多，差異有顯著性(P<0.05);與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織和血清中TG、TC含量明顯減少，差異有顯著性(P<0.05);與BIFI高劑量組比較，Tenovin-6組大鼠肝組織和血清中TG、TC含量明顯增多，見表2。
2.3BIFI對CALI大鼠肝組織結構的影響
組織病理學表現顯示，對照組大鼠肝小葉形態完整，肝細胞排列緊密規則、無脂滴堆積，未見炎性細胞，肝組織結構正常。CALI組大鼠肝呈脂肪性病變，肝小葉結構不完整，肝細胞破碎、腫脹，排列疏松，出現大量脂滴和炎性細胞浸潤，呈病理損傷狀態。BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織損傷程度減輕，破碎和炎性肝細胞數量減少，肝細胞形態相對規則。Tenovin-6組大鼠肝呈病理損傷狀態。(圖1)
2.4BIFI對CALI大鼠SIRT1/ChREBP通路的影響
如圖2所示，與對照組比較，CALI組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達明顯降低，ChREBP蛋白表達明顯增高，差異有顯著性(P<0.05);與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達明顯增高(P<0.05)，ChREBP蛋白表達明顯降低(P<0.05);與BIFI高劑量組比較，Tenovin-6組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達明顯降低(P<0.05)，ChREBP蛋白表達明顯增高(P<0.05)，見表3。
3討論
酒精是導致酒精性肝損傷(CALI)的關鍵致病因子，大量研究表明，飲用酒精量越大，飲酒時間越長，肝損傷程度越嚴重[7]。ALD肝損傷早期多呈現出脂肪肝癥狀、隨著疾病嚴重程度的增加，依次進展為肝炎癥、肝組織纖維化、肝硬化等，嚴重者導致大面積肝組織細胞壞死，甚至肝衰竭，威脅患者生命[8]。其中肝脂肪增多是ALD發生發展的重要原因之一[9]。很多醫者認為，戒酒是改善酒精性肝病患者肝損傷的根本方法，是治療CALI患者最基本的措施[10]。在酒精所致肝損傷過程中，首要發生的是脂肪性病變。本研究根據前人報道的方法，采用連續酒精灌胃的方式制備CALI模型大鼠，結果顯示，連續灌胃8周后，CALI組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯增高，肝組織和血清中TG、TC含量均明顯增多，且肝組織肝小葉結構不完整，肝細胞破碎、腫脹，排列疏松，出現大量脂滴和炎性細胞浸潤，呈脂肪性病變狀態，表明CALI模型制備成功。
腸道菌群在人體能量代謝、營養吸收中發揮關鍵作用，腸道菌群的紊亂可導致一系列疾病，而合理增加有益菌群可改善機體代謝[11]。大量研究表明，采用益生菌預處理可減輕非酒精性脂肪肝患者的肝功能損傷[12-13]。Porras等[14]研究發現，槲皮素可通過調節腸道菌群失衡及相關的肝-肝軸激活，發揮對高脂飲食誘導的小鼠非酒精性脂肪肝的保護作用，提示腸道菌群可調節肝功能。Janssen等[15]進一步研究發現，腸道菌群的調節可有效減輕非酒精性脂肪肝小鼠肝中脂肪組織質量，減輕炎癥反應，改善肝纖維化程度，提示腸道菌群對非酒精性肝脂肪性病變具有一定保護作用。本研究發現，與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯降低，表明BIFI具有保護慢性酒精所致肝功能損傷的功能。另外，與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組肝組織和血清中TG、TC含量明顯減少，破碎和炎性肝細胞數量減少，肝組織損傷程度明顯減輕，表明BIFI具有改善慢性酒精性肝損傷過程中脂質堆積的功能，與Chen等[16]在高脂飲食誘導的脂肪肝大鼠中研究一致。進一步研究發現，BIFI對CALI大鼠脂肪堆積的抑制作用和對肝功能損傷的保護作用可被SIRT1抑制劑Tenovin-6特異性地抑制，提示BIFI對CALI大鼠脂肪代謝的促進作用和對肝功能損傷的保護作用可能與SIRT1通路有關。
SIRT1在哺乳動物體內廣泛表達，通過調節組蛋白乙酰化/去乙�；�，調節DNA與組蛋白的結合狀態，影響基因轉錄，在細胞凋亡、能量代謝、炎癥反應、氧化還原平衡等生理過程中發揮重要作用[17]。Jeon等[18]發現，SIRT1在肥胖性脂肪肝小鼠肝組織中表達下調，敲除SIRT1可顯著增加脂肪肝小鼠肝病變程度和炎癥水平，提示SIRT1可能預防高脂飲食誘導的肥胖性肝損傷。另外Liangpunsakul等[19]發現，乙醇喂養小鼠可導致其肝中ChREBP表達上調，抑制其表達則可改善乙醇所致小鼠肝損傷。Gao等[20]研究發現，香石酸可通過促進SIRT1表達，抑制ChREBP表達抑制酒精性肝損傷大鼠肝組織中氧化應激和炎癥反應，降低大鼠血脂水平，保護酒精所致大鼠肝損傷。以上研究表明，SIRT1/ChREBP在脂肪性肝損傷中發揮重要作用。本研究發現，與對照組比較，CALI組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達明顯降低，ChREBP蛋白表達明顯增高，與過往文獻報道一致，表明SIRT1/ChREBP參與酒精所致大鼠肝損傷過程。進一步研究顯示，與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達明顯增高，ChREBP蛋白表達明顯降低，表明BIFI具有激活SIRT1表達，抑制ChREBP表達的可能。同時，這種調節SIRT1、ChREBP蛋白的作用被SIRT1抑制劑Tenovin-6特異地抑制，提示BIFI可能通過促進SIRT1表達，抑制ChREBP表達，抑制肝中脂質合成。
綜上所述，BIFI可能通過促進SIRT1表達，抑制ChREBP表達，減輕CALI大鼠體內脂質合成，實現對慢性酒精性肝損傷大鼠的肝保護作用。
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