cgVEGF164基因對小鼠毛囊生長的影響

發(fā)布時間：2020-03-17所屬分類：醫(yī)學論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要:血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一種二聚體糖蛋白，能夠誘導毛囊血管內皮細胞的增殖和遷移，調節(jié)毛囊周圍毛細血管生成，進而影響毛囊的生長發(fā)育。已知cgVEGF164是絨山羊VEGF-A基因的一種主要剪接變體，但cgVEGF164基因是否具

　　摘要:血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一種二聚體糖蛋白，能夠誘導毛囊血管內皮細胞的增殖和遷移，調節(jié)毛囊周圍毛細血管生成，進而影響毛囊的生長發(fā)育。已知cgVEGF164是絨山羊VEGF-A基因的一種主要剪接變體，但cgVEGF164基因是否具有調控毛囊生長發(fā)育的作用目前尚不清楚。為初步探究cgVEGF164基因對毛囊生長的影響及其機制，本研究通過原核顯微注射制備cgVEGF164轉基因過量表達小鼠。通過HE染色法比較轉基因小鼠和非轉基因對照小鼠毛囊的直徑和密度，利用WesternBlot檢測小鼠背部皮膚中信號蛋白ERK1/2、AKT1、LEF1的磷酸化水平。本研究成功獲得5只陽性cgVEGF164轉基因小鼠(雌雄比為4:1，陽性率8.5%);與非轉基因對照小鼠相比，轉基因小鼠毛囊直徑增大、密度增加;經檢測轉基因小鼠中ERK1/2、AKT1、LEF1的磷酸化水平均上調。結果表明，cgVEGF164基因具有促進小鼠毛囊生長的作用，推測該功能可能與cgVEGF164影響ERK1/2、AKT1和LEF1等信號蛋白的磷酸化有關。

　　關鍵詞:cgVEGF164;轉基因小鼠;毛囊生長;磷酸化

　　毛囊的性狀和結構決定動物毛發(fā)的品質，研究毛囊生長調控機制對于提高產絨動物產絨量至關重要。毛囊生長所需的營養(yǎng)物質以及調控生長所需的各類細胞因子均由其周圍血管(循環(huán)系統(tǒng))提供，因而充足的血液供應是毛囊細胞生長分化的基礎。哺乳動物的毛囊通常呈現(xiàn)周期性變化，包括生長期、退行期和休止期[1,2]。研究顯示，毛囊周圍的毛細微血管會隨著毛囊周期的變化而變化，毛細微血管在毛囊生長期比較發(fā)達，進入退行期后逐漸退化[3~5]。

　　血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一種由二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，能夠促進血管再生和調節(jié)血管滲透性[6,7]。研究證實，VEGF通過與血管內皮生長因子受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)相互作用，促進血管內皮細胞的增殖和遷移[8,9]。皮膚中VEGF基因的表達水平在毛囊生長期上調，進入退行期后逐漸降低，在休止期則基本消失[4,6]。在小鼠毛囊結構中，VEGF基因主要在外根鞘和毛乳頭中表達[10]，進而誘導毛囊周圍毛細血管的形成，促進外根鞘和毛乳頭細胞的增殖[11,12]，增大毛囊直徑和毛干長度[13]。

　　由于mRNA剪切方式的不同，在人中已發(fā)現(xiàn)7種VEGFmRNA剪接變體，包括VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189、VEGF148和VEGF206[14~16]。已知cgVEGF164是絨山羊VEGF-A基因的一種主要剪接變體，在絨山羊腦、心臟、睪丸、胰腺、脾、腎和肺中都有表達，與人源VEGF165基因的同源性高達94%[17]。已有研究證實VEGF165基因能夠促進毛發(fā)生長[18~20]，而cgVEGF164基因是否具有調控毛囊生長發(fā)育的作用目前尚不清楚。本研究旨在通過原核顯微注射法，獲得cgVEGF164轉基因小鼠，比較轉基因小鼠與非轉基因對照小鼠毛囊的直徑和數(shù)量以及相關信號蛋白ERK1/2、AKT1、LEF1磷酸化水平的變化，探討外源基因cgVEGF164對毛囊生長的影響及調節(jié)機制，為利用現(xiàn)代生物學技術手段提高產絨動物的產絨量提供實驗依據。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　BDF1雌鼠、CD-1雄鼠、C57小鼠均由內蒙古大學國家清潔級實驗動物繁育室提供。所有研究符合內蒙古大學動物倫理委員會的規(guī)定并授權。K14-cgVEGF164載體由內蒙古大學王志鋼教授提供[17]，其啟動子為Keratin14(K14)，外源基因為cgVEGF164。

　　1.2注射用外源基因的制備

　　用限制性內切酶BglⅡ對K14-cgVEGF164質粒載體進行線性化酶切，獲得線性化K14-cgVEGF164質粒載體。用乙醇沉淀法對線性化K14-cgVEGF164質粒載體進行純化，最后用TE緩沖液溶解并調整濃度為1.5ng/µL。用分光光度計測定OD值，OD值在1.7~1.9之間才可注射。

　　1.3原核顯微注射

　　原核顯微注射法制備轉基因小鼠參考文獻[21]中的方法。將6~7周齡性成熟的BDF1母鼠與CD1公鼠合籠，20h后取見栓母鼠的受精卵。將1×10-6µL左右含K14-cgVEGF164質粒載體的注射液注入胚胎雄原核，注射完畢后將胚胎移入KSOM培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱。30min后選取25~30枚注射后存活胚胎移入經麻醉處理的假孕母鼠輸卵管壺腹部。移植后將假孕母鼠放置于保溫板上待其蘇醒后放回鼠房，懷孕成功母鼠約19天后分娩產仔。

　　1.4PCR檢測

　　根據K14-cgVEGF164質粒載體的序列信息，設計一對用于檢測外源基因整合的PCR引物。引物信息：

　　F：5'-CAGGGTCCGATGGGAAAGTGTA-3';

　　R：5'-TGCTGGCTTTGGTGAGGTTTGA-3'。擴增產物為675bp，產物橫跨K14啟動子和cgVEGF164基因。待出生幼鼠長至3周時，剪取約0.5cm尾尖提取基因組DNA，進行PCR鑒定，確定轉基因陽性小鼠。PCR擴增條件：95℃預變性10min，95℃變性30s，60℃復性42s，72℃延伸45s，共30個循環(huán);最后再72℃延伸7min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

　　1.5qRT-PCR分析

　　取10周齡cgVEGF164轉基因小鼠為實驗組，保留同窩的陰性小鼠為非轉基因對照組。脫毛后剪取背部皮膚組織，液氮研磨后加入800µLRNAisoPlus，按RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA，利用反轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)合成cDNA。qRT-PCR擴增體系為20µL，包括：SYBRPremixExTaqⅡ(2×)10µL，上、下游引物各0.4μL，RoxReferenceDye(50×)0.4µL，ddH2O6.8µL，cDNA2µL。qRT-PCR擴增條件：95℃預變性30s;95℃變性10s，60℃延伸30s，40個循環(huán)，每個樣品進行3次重復。根據每個樣品與內參基因GAPDH所得的Ct值，利用2-ΔΔCt公式分析目的基因cgVEGF164mRNA的相對表達量。目的基因cgVEGF164和內參基因GAPDH的擴增引物見表1。

　　1.6WesternBlot檢測

　　取轉基因小鼠和同窩非轉基因對照小鼠皮膚組織，放于1.5mL離心管內剪碎，RIPA裂解液裂解細胞，收集蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉PVDF膜。封閉后，相應一抗(VEGF164ab53465、α-tubulinab15246、ERK1/2ab17942、P-ERK1/2ab50011、AKT1ab32505、P-AKT1ab66138、LEF1ab137872、P-LEF1ab74067均購自美國Abcam公司)4℃孵育過夜，羊抗兔二抗(ab6721購自美國Abcam公司)室溫孵育1h。最后利用Tanon5200全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行曝光處理。

　　1.7HE染色與免疫熒光

　　選取cgVEGF164轉基因小鼠和同窩非轉基因對照小鼠的背部組織進行固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟、蘇木精與伊紅染色。VEGF164一抗(1∶200)過夜孵育，羊抗兔二抗(ab6717購自美國Abcam公司)(1∶1000)孵育1h進行免疫熒光染色。

　　1.8數(shù)據分析

　　cgVEGF164mRNA和VEGF164蛋白的相對表達量，毛囊的直徑、密度，ERK1/2、AKT1、LEF1磷酸化水平等數(shù)據均以平均數(shù)和平均數(shù)的標準差表示，采用GraphPadPrism6軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據均進行3次以上重復實驗。P>0.05表示沒有統(tǒng)計學差異，用“N.S.”(Nosignificance)表示;P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，具有統(tǒng)計學意義。

　　相關期刊推薦：《遺傳》雜志是中國遺傳學會和中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所主辦、科學出版社出版的學術期刊，中國科技核心期刊。本刊的任務是報道國內外遺傳學最新研究成果與進展，推動學科進步。讀者對象為基礎醫(yī)學、農學、生命科學領域的科研、教學及開發(fā)人員，大學生、研究生、中學生物教師等。曾用刊名：遺傳與育種。

　　2結果與分析

　　2.1cgVEGF164轉基因小鼠的鑒定

　　本研究共移植原核注射胚胎296枚，獲得59只仔鼠，經PCR法初步鑒定共獲得5只轉基因小鼠(圖1A)，其編號分別為878號、890號、1008號、1018號和1021號，陽性率為8.5%。將F0代cgVEGF164轉基因小鼠和野生型C57小鼠交配，獲得F1代小鼠。將F1代cgVEGF164轉基因小鼠自交獲得F2代cgVEGF164轉基因小鼠。出生仔鼠用與原代小鼠相同的鑒定方法進行鑒定。所有F0代轉基因陽性小鼠都能夠將外源基因傳遞給子代(表2)。其中1008號小鼠共獲得6只F2代cgVEGF164轉基因小鼠，其編號分別為1311、1313、1316、1317、1319和1322(圖1B)。

　　2.2轉基因小鼠cgVEGF164mRNA及蛋白表達水平的檢測

　　利用qRT-PCR、WesternBlot和免疫熒光染色檢測5只轉基因小鼠與同窩非轉基因對照小鼠皮膚cgVEGF164mRNA及蛋白的相對表達量。結果顯示，890、1008、1018、1021號轉基因陽性小鼠中cgVEGF164mRNA及VEGF164蛋白的相對表達量均高于同窩非轉基因對照小鼠，而878號轉基因陽性小鼠中cgVEGF164mRNA及VEGF164蛋白的相對表達量與其同窩非轉基因對照小鼠沒有顯著性差異(圖2，A~D)。890號轉基因陽性小鼠cgVEGF164mRNA相對表達量最高，是同窩對照小鼠886號的6.25倍(圖2A);1008號轉基因陽性小鼠VEGF164蛋白表達量最高，是同窩對照小鼠1013號的1.68倍(圖2，B和C)。經免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)VEGF164蛋白主要分布于毛囊球部(圖2D)。

　　2.3轉基因小鼠cgVEGF164mRNA組織表達譜檢測及表型分析

　　為探究cgVEGF164在轉基因小鼠各組織中的表達水平，本研究將1008號cgVEGF164轉基因小鼠F2代作為實驗組，其同窩的非轉基因小鼠作為對照組，觀察實驗組與對照組小鼠表型的變化，并利用qRT-PCR檢測轉基因和非轉基因小鼠各組織中cgVEGF164mRNA表達水平。結果表明，與非轉基因對照小鼠相比，8周齡cgVEGF164轉基因小鼠的表型無異常變化，生長狀況良好(圖3A)。轉基因小鼠腦、脂肪、肌肉、肝臟、肺、脾臟、腎臟、心臟、胃、大腸、小腸、睪丸、卵巢等組織中cgVEGF164mRNA的相對表達量均高于皮膚組織(圖3B);與非轉基因對照小鼠相比，cgVEGF164在轉基因小鼠腦、脂肪、肌肉、肝臟、肺、脾臟、腎臟、心臟、胃、大腸、小腸、睪丸、卵巢等組織中的表達量并沒有顯著升高(圖3C)，這可能與K14啟動子是表皮特異啟動子有關，表明外源cgVEGF164基因對轉基因小鼠其他組織的影響比較小。

　　2.4cgVEGF164基因對小鼠毛囊生長的影響

　　本研究將1008號cgVEGF164轉基因小鼠F2代作為實驗組，其同窩非轉基因小鼠作為對照組，待小鼠生長到10周齡時，將兩組小鼠背部剃毛后，取背部組織制備組織切片，經HE染色后觀察。結果顯示，與非轉基因對照小鼠相比，轉基因小鼠的毛囊直徑明顯增大(圖4A)，毛囊密度顯著升高(圖4B)。轉基因小鼠毛囊深入真皮層，而非轉基因對照小鼠毛囊在真皮層比較淺的位置(圖4C)。

　　2.5VEGF下游信號通路蛋白的檢測

　　利用WesternBlot方法檢測轉基因小鼠與非轉基因對照小鼠VEGF下游蛋白ERK1/2、P-ERK1/2、AKT1、P-AKT1、LEF1、P-LEF1的相對表達量，α-tubulin作為內參蛋白，結果如圖5A所示。通過灰度值計算P-ERK1/2、P-AKT1、P-LEF1分別占ERK1/2、AKT1、LEF1表達量的百分比，結果發(fā)現(xiàn)轉基因小鼠中P-ERK1/2/ERK1/2、P-AKT1/AKT1、P-LEF1/LEF1分別為44%、51%、11%，均高于對照組18%、11%、8%(圖5B)。

　　3討論

　　轉基因動物是指通過轉基因技術將外源基因整合到動物的基因組中，從而使外源基因在動物體內表達并且可以穩(wěn)定遺傳[22]。建立轉基因動物模型，對研究外源基因在動物體內的功能和表達調控機制具有至關重要的作用[23,24]。本研究利用原核顯微注射技術制作cgVEGF164轉基因小鼠模型，旨在研究cgVEGF164基因對小鼠毛囊生長的影響。經PCR初步鑒定，確定5只小鼠成功轉入了cgVEGF164基因(編號分別是878、890、1008、1018、1021)，陽性率為8.5%。經qRT-PCR和WesternBlot進一步檢測分析，獲得4只高表達cgVEGF164的轉基因陽性小鼠(編號分別是890、1008、1018、1021)。878號小鼠雖然成功轉入了cgVEGF164基因，但其cgVEGF164mRNA和蛋白表達量不高于非轉基因對照小鼠，推測原因可能是由于本研究中構建的轉基因表達載體屬于隨機整合載體，外源基因雖然發(fā)生了基因組整合，但其轉錄和蛋白質表達效率將受到整合位點的影響而不可預測。由于K14啟動子是表皮特異啟動子，因而與非轉基因對照小鼠相比，cgVEGF164基因在轉基因小鼠腦、脂肪、肌肉、肝臟、肺、脾臟、腎臟、心臟、胃、大腸、小腸、睪丸、卵巢等組織中的表達量并沒有顯著升高。

　　cgVEGF164基因編碼一段由190個氨基酸構成的多肽，其N端的26個氨基酸序列與人源VEGF165的N端完全相同，屬信號肽序列，推測該序列與其分泌功能有關[25,26]。VEGF是血管再生的關鍵因子，通過促進毛囊周圍毛細血管的生長，進而影響毛發(fā)生長和毛囊周期[27]。本研究使用HE染色法對小鼠背部組織切片進行染色觀察，結果發(fā)現(xiàn)，與非轉基因對照小鼠相比cgVEGF164轉基因小鼠毛囊的直徑和密度均增加，毛囊深入真皮層，表明cgVEGF164基因具有促進毛囊生長的作用。

　　為進一步探究cgVEGF164基因參與小鼠毛發(fā)生長的調節(jié)機制，本研究通過檢測信號蛋白ERK1/2、AKT、LEF1的磷酸化水平初步確定cgVEGF164與MAPK/ERK1/2、PI-3K-AKT1/PAK和Wnt/β-catenin/LEF1等信號通路的聯(lián)系。ERK1/2、AKT1、LEF1是與VEGF信號通路相關的下游信號蛋白，在促進毛發(fā)生長和調節(jié)毛囊周期中扮演重要角色。ERK1/2是MAPK家族成員之一，參與VEGF調節(jié)表皮細胞的增殖[1,12,28,29]。AKT也是MAPK家族成員之一，能夠與VEGFR作用促進表皮細胞的存活和增殖[15,30]。LEF1是Wnt途徑中主要成員之一，與β-catenin蛋白結合作用于VEGF，調控毛囊周期促進毛發(fā)再生[31~33]。研究結果顯示，cgVEGF164轉基因小鼠背部上皮中ERK1/2、AKT1、LEF1磷酸化水平均高于非轉基因對照小鼠，由此我們推斷cgVEGF164基因通過促進RK1/2、AKT1、LEF1磷酸化調控毛囊的生長。但是，毛囊的生長是多種生物因子綜合作用的結果，cgVEGF164基因調控毛囊生長的分子機制還需要進一步深入研究。