發(fā)布時(shí)間：2020-02-13所屬分類(lèi)：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:病原微生物是危害人類(lèi)健康的最主要影響因素之一,快速、準(zhǔn)確地鑒定病原微生物對(duì)保障人類(lèi)健康具有重要意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-meditatedisothermalamplification,LAMP)是一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),具有特異性高、靈敏度高、快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的優(yōu)
摘要:病原微生物是危害人類(lèi)健康的最主要影響因素之一,快速、準(zhǔn)確地鑒定病原微生物對(duì)保障人類(lèi)健康具有重要意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-meditatedisothermalamplification,LAMP)是一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),具有特異性高、靈敏度高、快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。可以與其他新技術(shù)結(jié)合,彌補(bǔ)其引物設(shè)計(jì)困難和易被污染的不足,使其能夠在更多領(lǐng)域應(yīng)用,尤其是在資源貧乏地區(qū)的基因檢測(cè)以及食品的快速檢測(cè)和基層檢測(cè)。本文就環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的基本原理、特點(diǎn)及在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用對(duì)近些年的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,并對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行展望,為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供參考。
關(guān)鍵詞:環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;病原微生物;基本原理;快速檢測(cè);基層檢測(cè)
1引言
我們生活在微生物的時(shí)代,微生物影響著我們生活的方方面面。我們一方面享受著微生物帶來(lái)的便利,如品嘗著醇香的白酒,享用著美味的奶酪等。另一方面,我們也飽受微生物的困擾,由各種微生物帶來(lái)的食物中毒,病菌感染時(shí)刻威脅著我們的身體健康,這些能夠引起人類(lèi)或動(dòng)物疾病的微生物又被稱(chēng)為病原微生物,它包括病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等[1]。它們可以通過(guò)空氣、食物等途徑傳播且傳播速度極快[2]。因此,對(duì)病原微生物進(jìn)行快速的檢測(cè)能夠讓我們提前發(fā)現(xiàn)并解決其帶來(lái)的危害。在過(guò)去的幾十年里,病原微生物檢測(cè)和鑒定方面取得了巨大進(jìn)步,現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測(cè)方法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法,以及以此類(lèi)方法為基礎(chǔ)、多學(xué)科交叉發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)技術(shù),如傳感器技術(shù)、生物芯片技術(shù)等。傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果相對(duì)精確,但耗時(shí)太長(zhǎng),若同時(shí)檢測(cè)大量樣品,工作量大且效率不高。免疫學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果靈敏度高,特異性強(qiáng),檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短,但依賴(lài)于昂貴的檢出設(shè)備,難以普及至基層檢測(cè)。分子生物學(xué)檢測(cè)方法中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse-transcription-polymerasechainreaction,RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timepolymerasechainreaction,real-timePCR)等是現(xiàn)在應(yīng)用較廣的檢測(cè)技術(shù),但這些方法較為繁瑣或是依賴(lài)于較昂貴的設(shè)備,難以適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
相關(guān)期刊推薦：《食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)》(雙月刊)創(chuàng)刊于2009年，是國(guó)內(nèi)首本專(zhuān)注于食品安全與質(zhì)量的科技期刊，它所刊登的論文將反映食品安全和質(zhì)量控制的研究熱點(diǎn)、前沿技術(shù)及發(fā)展方向。內(nèi)容范圍：應(yīng)用于食品安全和質(zhì)量控制的新技術(shù)、新方法、新材料、新工藝、新裝置、新設(shè)備和新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究，食品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，各種工程技術(shù)、信息技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于食品安全及質(zhì)量控制的研究，食品生物技術(shù)的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用研究, 食品相關(guān)管理政策、標(biāo)準(zhǔn)、法律解讀以及行業(yè)資訊信息。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-meditatedisothermalamplification,LAMP)是Notomi等[3]開(kāi)發(fā)的一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。它依靠2對(duì)引物,在恒定的溫度(61~65℃),在具有高鏈置換活性的DNA聚合酶作用下,以脫氧核糖核苷三磷酸為原料進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。反應(yīng)能在1h內(nèi)完成,具有快速、簡(jiǎn)易、高特異性,不依賴(lài)于昂貴檢測(cè)設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)[4],使其能夠用于資源貧乏地區(qū)的基因檢測(cè)、食品和環(huán)境樣品的快速檢測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本文就LAMP的原理、特點(diǎn)及近些年的發(fā)展及應(yīng)用進(jìn)行綜述,并對(duì)其未來(lái)發(fā)展作出展望,為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供參考依據(jù)。
2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理、特點(diǎn)及應(yīng)用
2.1基本原理
LAMP的引物數(shù)量一般是4~6條。在設(shè)計(jì)時(shí),先確定目標(biāo)基因上的6個(gè)特異性區(qū)域F3、F2、F1、B1、B2、B3(圖1),F1c和B1c的熔解溫度(Tm)一般在64~66℃,F2、B2、F3、B3的Tm一般為59~61℃,然后依據(jù)這6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物:正向內(nèi)引物(forwardinnerprimer,FIP),由F1c和F2組成;反向內(nèi)引物(backwardinnerprimer,BIP),由B1c和B2組成,中間均以TTTT作為間隔,內(nèi)引物長(zhǎng)度一般在30~44個(gè)堿基;外引物F3、B3分別由目的基因上的F3、B3區(qū)域組成,長(zhǎng)度一般為15~20個(gè)堿基。Nagamine等[5]提出增加一對(duì)促環(huán)引物L(fēng)F和LB參與反應(yīng),可以提高擴(kuò)增效率,將反應(yīng)時(shí)間縮短三分之一甚至二分之一。
LAMP主要有3個(gè)階段,第一階段,模板合成階段,在LAMP反應(yīng)體系中,內(nèi)引物的濃度幾倍于外引物的濃度,因此,內(nèi)引物會(huì)先與模板鏈結(jié)合合成互補(bǔ)鏈,形成DNA雙鏈。隨后外引物再與該模板鏈結(jié)合,形成DNA雙鏈,在BstDNA聚合酶的作用下,釋放出由內(nèi)引物合成的互補(bǔ)鏈,該互補(bǔ)鏈經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)最終形成具有啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA單鏈,該單鏈?zhǔn)呛罄m(xù)循環(huán)擴(kuò)增的模板。第二階段,循環(huán)擴(kuò)增階段,以啞鈴結(jié)構(gòu)DNA單鏈自身為模板依據(jù)第一階段的反應(yīng)原理不斷形成一端開(kāi)口的過(guò)渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA。該DNA鏈作為第三階段的反應(yīng)模板。第三階段,延長(zhǎng)和再循環(huán)階段,由內(nèi)外引物引導(dǎo)過(guò)渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應(yīng),最后形成具有多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)和花椰菜結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度不一的DNA混合物[5]。
2.2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)特點(diǎn)及其發(fā)展
2.2.1LAMP特點(diǎn)
LAMP將模板加入反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后目視觀察即可判斷反應(yīng)是否發(fā)生,步驟簡(jiǎn)單;LAMP的等溫?cái)U(kuò)增特性使其只需一個(gè)恒溫水浴鍋就能滿足反應(yīng)要求,儀器成本低;同時(shí)它也不需要進(jìn)行DNA的變性及復(fù)性步驟,節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間。其次,4條引物的特異性識(shí)別,提高了擴(kuò)增效率。LAMP結(jié)果觀察和產(chǎn)物檢測(cè)主要有3種方法,一為濁度法,LAMP反應(yīng)過(guò)程中會(huì)生成焦磷酸鎂沉淀,通過(guò)觀察是否產(chǎn)生沉淀判斷反應(yīng)是否發(fā)生,同時(shí)由于沉淀的產(chǎn)生會(huì)改變反應(yīng)液的濁度,因此可測(cè)定實(shí)時(shí)濁度實(shí)現(xiàn)LAMP的定量檢測(cè)[6,7]。二為熒光檢測(cè)法。在LAMP反應(yīng)體系中加入二價(jià)錳離子和鈣黃素,若反應(yīng)成功擴(kuò)增,在紫光燈或是日光的照射下能看到溶液顏色為明亮的綠色[8],可以實(shí)現(xiàn)LAMP的不開(kāi)蓋可視化檢測(cè),避免氣溶膠污染。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),SYBRGreen染料具有比鈣黃素更高的靈敏度,向反應(yīng)體系中加入相應(yīng)比例的熒光染料,測(cè)定反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光值,可實(shí)現(xiàn)LAMP的定量檢測(cè)。三為凝膠電泳法。將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,根據(jù)是否看到階梯狀條帶判斷反應(yīng)是否發(fā)生。
2.2.2逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification,RT-LAMP)基本原理與操作與常規(guī)LAMP基本相同,不同的是擴(kuò)增模板使用的是RNA,需在反應(yīng)開(kāi)始前向體系內(nèi)加入逆轉(zhuǎn)錄酶。RT-LAMP具有與LAMP相似的靈敏度和特異性。
2.2.3多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(multiplexloop-mediatedisothermalamplification,multiplexLAMP)是指在單管反應(yīng)體系試劑內(nèi)加入幾組引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)酶切反應(yīng)、實(shí)時(shí)熒光或是實(shí)時(shí)濁度測(cè)定實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原微生物的特異性檢驗(yàn)[9]。其優(yōu)點(diǎn)是在保證特異性和靈敏度的前提下提高檢測(cè)效率,節(jié)約試劑成本和時(shí)間成本,但也存在一些不足,首先,所需引物數(shù)量多,為避免形成引物二聚體及二級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)生非特異性擴(kuò)增,對(duì)引物的要求變高,增加了引物設(shè)計(jì)的難度。其次,在對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析時(shí),存在酶切時(shí)間長(zhǎng),酶切產(chǎn)物不單一,結(jié)果難以準(zhǔn)確判斷以及開(kāi)蓋可能造成的氣溶膠污染等問(wèn)題。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光或是實(shí)時(shí)濁度測(cè)定,進(jìn)行熔解曲線分析能夠很好地避免氣溶膠污染以及檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題,但也存在儀器成本較高、操作繁瑣,不適用于基層檢測(cè)以及目前最高只能進(jìn)行四重反應(yīng)等問(wèn)題。
2.2.4與橫向流動(dòng)裝置結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
橫向流動(dòng)裝置(lateralflowdevice,LFD)是一種基于試紙條的色譜檢測(cè)平臺(tái),利用反應(yīng)體系中異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交,然后在橫向流動(dòng)試紙條上進(jìn)行抗原抗體結(jié)合及顯色,完成結(jié)果判斷[10]。利用LFD檢測(cè)RT-LAMP擴(kuò)增后的產(chǎn)物,可以有效地降低假陽(yáng)性概率,簡(jiǎn)化操作步驟,同時(shí)節(jié)省時(shí)間。但其需要設(shè)計(jì)特異性探針,一定程度上增加了檢測(cè)成本。
2.2.5微流控環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
微流控是將樣品分析從前處理到反應(yīng)再到結(jié)果檢測(cè)等一系列連續(xù)操作過(guò)程整合到一個(gè)微型芯片上,從而實(shí)現(xiàn)分析過(guò)程自動(dòng)化的一項(xiàng)技術(shù)。該技術(shù)可以為L(zhǎng)AMP核酸檢測(cè)系統(tǒng)提供形狀、大小不同的微量密閉反應(yīng)通道及微反應(yīng)空間,可以較好避免氣溶膠污染,提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性[11]。但它也存在不足,如靈敏度不高,DNA樣本需經(jīng)過(guò)前處理富集、微流控裝置需要專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)以及微流體材料選擇等問(wèn)題。
2.2.6乳液微滴數(shù)字分析技術(shù)與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合
乳液微滴數(shù)字分析技術(shù)是屬于數(shù)字核酸檢測(cè)技術(shù)dNAD的一種,主要是使用乳液密封磁珠的方法,與磁珠的單分子捕獲和磁珠原位LAMP擴(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合構(gòu)建一個(gè)高通量的數(shù)字核酸檢測(cè)平臺(tái)[12]。該平臺(tái)可以在1.5h內(nèi)完成樣本的檢測(cè),并且可以達(dá)到300個(gè)拷貝/mL的檢測(cè)限和實(shí)現(xiàn)高精度的絕對(duì)定量。
3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用
3.1LAMP在細(xì)菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用
在細(xì)菌檢測(cè)方面,傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法一直是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),但是該方法步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,使用更簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是未來(lái)的必然需求。LAMP具有快速、特異性高等優(yōu)點(diǎn),使其能夠應(yīng)用到細(xì)菌檢測(cè)。目前,國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于其應(yīng)用的研究。如Yano等[13]使用LAMP對(duì)腸毒素大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè),其最低檢出限為4CFU/mL;樊粉霞等[14]利用RT-LAMP對(duì)血液樣本中的傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè),最低檢出限為7CFU/mL,與RT-PCR比較,其靈敏度更高。在LAMP反應(yīng)中,樣品中存在的死菌會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果。與DNA相比,RNA更容易在死菌中降解,擴(kuò)增結(jié)果不易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。梁玉林等[15]以金黃色葡萄球菌的RNA為模板進(jìn)行RT-LAMP,結(jié)果表明只要擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果不大于107CFU/mL,就能很好地避免由于死菌擴(kuò)增造成的假陽(yáng)性結(jié)果。一些研究結(jié)果表明,LAMP對(duì)鮮肉[16]、奶粉和速凍水餃[17]中的金黃色葡萄球菌檢測(cè)具有較好的檢出限。Chen等[18]在提取DNA模板后,用疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide,PMA)溶液對(duì)DNA模板進(jìn)行一定時(shí)間的處理,也可以很好地排除死菌的干擾,除此之外,疊氮溴化丙錠環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(PMA-LAMP)檢測(cè)瓜果中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌靈敏度比疊氮溴化丙錠-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PMA-PCR)高100倍。但是PMA是一種強(qiáng)烈致癌物質(zhì),不適合推廣使用。Xia等[12]建立了一個(gè)基于蒙特卡羅方法、泊松統(tǒng)計(jì)和化學(xué)計(jì)量學(xué)理論的數(shù)學(xué)模型,并制造了一個(gè)帶有1200個(gè)均勻和離散反應(yīng)室(9.6nL)的螺旋芯片,該螺旋芯片實(shí)現(xiàn)了核酸濃度(跨越度超過(guò)4個(gè)數(shù)量級(jí))的定量分析,將該芯片與LAMP結(jié)合,形成數(shù)字化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(dLAMP),使用該法對(duì)病原性DNA樣品進(jìn)行絕對(duì)定量,最低檢出限可達(dá)87copies/mL。金婷婷[19]將免疫捕獲技術(shù)與LAMP技術(shù)結(jié)合,使用免疫捕獲技術(shù)預(yù)處理待檢測(cè)的人工污染全脂乳,再用LAMP法檢測(cè)樣品,最低檢出限可達(dá)到8CFU/mL,而Ravan等[20]未使用該預(yù)處理技術(shù)的LMAP法的檢出限僅為103CFU/mL。其最低檢出限有了顯著提高,同時(shí)在保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下,也縮短了樣品前處理時(shí)間。Connelly等[10]設(shè)計(jì)了一種基于紙質(zhì)微流體的集成備,配合手持紫外燈和手機(jī)相機(jī),對(duì)人血漿中的大腸埃希氏菌進(jìn)行了半定量檢測(cè)。Tamura等[21]將擴(kuò)增難治性突變系統(tǒng)(amplificationofrefractorymutantsystems,ARMS)與LAMP結(jié)合起來(lái),建立了擴(kuò)增難治性突變系統(tǒng)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,該方法能夠?qū)α鞲惺妊獥U菌中的ftsI基因中的核苷酸(1578T)進(jìn)行物種特異性檢測(cè),而不擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐青霉素抗性中攜帶點(diǎn)突變(T1578G/A)的序列。最低檢出限為10.0pg/reaction。Feng等[22]利用寡核苷酸適配子磁捕獲技術(shù)(adaptivemuonmagneticcapture,AMC)與LAMP技術(shù)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)李斯特菌的準(zhǔn)確、快速檢測(cè),檢出限為5CFU/mL,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)約3h。其他應(yīng)用[23-30]見(jiàn)表1。
3.2LAMP在真菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用
在真菌檢測(cè)方面,實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌的快速檢測(cè)與鑒定,對(duì)診斷、治療和預(yù)防由真菌以及其代謝產(chǎn)物引起的疾病有重要意義。Ferrara等[31]使用LAMP法對(duì)純培養(yǎng)的青霉菌進(jìn)行檢測(cè),最低檢出限為102fg/reaction;Vogt等[32]使用LAMP法檢測(cè)人工污染葡萄中的草酸青霉菌,最低檢出限為100pg/reaction;Luo等[33]使用Real-timeLAMP法檢測(cè)花生樣品中的黃曲霉,通過(guò)實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)反應(yīng)液的濁度進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定達(dá)到定量的目的,該法最小檢出限為102分生孢子/g;Kasahara等[34]對(duì)多條引物之間的組合進(jìn)行優(yōu)化,對(duì)反應(yīng)液的濁度進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定,成功實(shí)現(xiàn)了5種酵母菌的多重檢測(cè)且最小檢出限能達(dá)到100~103cells/mL。其他應(yīng)用[35-42]見(jiàn)表1。
3.3LAMP在病毒快速檢測(cè)中的應(yīng)用
病毒能夠引發(fā)各種人類(lèi)、動(dòng)物以及植物疾病。病毒在感染宿主后,通常會(huì)有一段時(shí)間的潛伏期,在這期間,病毒不會(huì)對(duì)宿主造成任何的破壞,而這段時(shí)間是我們治愈病毒性疾病的黃金時(shí)間。所以對(duì)病毒進(jìn)行快速、精確的檢測(cè)在臨床方面具有重要意義。Zhong等[43]使用LAMP對(duì)臨床樣本中的人類(lèi)乳頭狀瘤病毒進(jìn)行檢測(cè),最低檢出限為1000copies/reaction;Curtis等[44]用RT-LAMP對(duì)血液中的HIV-1進(jìn)行檢測(cè),最低檢出限能達(dá)到10-100copies/reaction;Nguyen等[45]用RT-LAMP對(duì)血液中的乙型肝炎病毒進(jìn)行檢測(cè),最小檢出限為2.218fg/μL;Gadkar等[46]設(shè)計(jì)了一種標(biāo)記的環(huán)狀探針,在未與目標(biāo)基因結(jié)合時(shí)保持淬滅狀態(tài),在與目標(biāo)基因結(jié)合后會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的特異性檢測(cè)。該技術(shù)被稱(chēng)為自猝滅環(huán)熒光探針-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(fluorescenceofloopprimeruponselfdequenching),使用該方法檢測(cè)水痘帶狀皰疹病毒,最小檢出限為102copies/µL;Fang等[47]將LAMP技術(shù)整合至一個(gè)八通道微流體芯片中,通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)量吸光度值實(shí)現(xiàn)偽狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV)的定量檢測(cè),最小檢出限為10fg/µL。Jung等[48]將免疫層析試紙條與多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合,對(duì)幾種甲型流感病毒進(jìn)行檢測(cè),最小檢出限為10copies/reaction。其他應(yīng)用[49-55]見(jiàn)表1。
3.4LAMP在原生動(dòng)物快速檢測(cè)中的應(yīng)用
原生動(dòng)物大多是不致病的,只有極少數(shù)會(huì)引起疾病,如阿米巴變形蟲(chóng)會(huì)引起阿米巴痢疾、孢子蟲(chóng)會(huì)引起瘧疾等。Yan等[56]用LAMP法檢測(cè)家蠶卵中的家蠶孢子蟲(chóng),最低檢出限能達(dá)到10孢子/mL;Mwendwa等[57]用LAMP法檢測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴,最低檢出限能達(dá)到30pg/mL;Yang[58]用LAMP法檢測(cè)棘阿米巴,最低檢出限為10copies/25μL。Lass等[59]用LAMP法檢測(cè)空氣中的剛地變形蟲(chóng),最低檢出限為102卵囊/cm2(過(guò)濾網(wǎng)表面積);Adaszek等[60]用LAMP法檢測(cè)狗身上的犬巴貝斯蟲(chóng),最低檢出限為0.1pg/μL。其他應(yīng)用[61-63]見(jiàn)表1。
4總結(jié)與展望
綜上所述,LAMP具有快速、簡(jiǎn)便、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)它也存在引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、反應(yīng)體系易污染、擴(kuò)增產(chǎn)物難定量等不足。彌補(bǔ)LAMP的不足能夠使它更好地應(yīng)用于檢測(cè)行業(yè)。因此,LAMP未來(lái)主要發(fā)展方向有,(1)進(jìn)一步優(yōu)化引物設(shè)計(jì)程序,降低引物設(shè)計(jì)難度。(2)與其他新技術(shù)結(jié)合,開(kāi)發(fā)出更為廉價(jià)、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的閉管檢測(cè)方法,避免氣溶膠污染。(3)尋找一種更為精確的核酸定量方法,解決LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物難以準(zhǔn)確定量的難題。(4)開(kāi)發(fā)廉價(jià)的檢測(cè)設(shè)備及檢測(cè)儀器設(shè)備的小型化和微型化。(5)與其他新技術(shù)結(jié)合,解決多重LAMP難以達(dá)到四重以上的局限,實(shí)現(xiàn)真正意義上的高通量檢測(cè)。
