發布時間：2020-02-12所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： [摘要]紅細胞是人體血液中含量最高的細胞成分。與傳統的基于合成材料的載體相比，紅細胞載體具有易獲得、容量大、生物相容性高、循環時間長、消除機制安全等顯著優勢。自20世紀70年代以來，對紅細胞載體藥物已進行了廣泛深入的研究，其中不少研究成果已展現
[摘要]紅細胞是人體血液中含量最高的細胞成分。與傳統的基于合成材料的載體相比，紅細胞載體具有易獲得、容量大、生物相容性高、循環時間長、消除機制安全等顯著優勢。自20世紀70年代以來，對紅細胞載體藥物已進行了廣泛深入的研究，其中不少研究成果已展現出良好的臨床應用前景。本文從載藥方法、主要優勢和不足等方面，綜述了近幾年來紅細胞載體藥物的研究成果，為相關領域的研究提供參考。
[關鍵詞]紅細胞;載體藥物;藥物遞送系統
近年來，為解決脂質體、納米顆粒等基于合成材料的藥物載體在生物相容性、半衰期和安全性等方面存在的問題，研究人員將目光開始聚焦到基于天然材料的仿生型藥物遞送系統上來[1]。很多藥物進入體循環后會與紅細胞發生相互作用，紅細胞在這些藥物的生物分布和代謝過程中扮演著重要角色，研究人員由此產生了主動利用紅細胞作為藥物遞送載體的想法[2]。
與合成藥物載體相比，紅細胞具有循環周期長、易獲得、比表面積和體積較大、生物相容性高、消除機制安全等特點。1953年，研究人員首次嘗試利用紅細胞運載化學物質。自1973年起，研究人員開始系統研究紅細胞載體藥物，到目前已形成了幾個主要的研究方向：①將分離得到的紅細胞膜包被在載藥納米顆粒外層，構建仿生納米載藥系統[3];②利用紅細胞制備細胞外囊泡包載藥物[4];③利用完整的活紅細胞直接負載藥物。筆者認為，利用紅細胞載藥是在提高載藥效率和保證紅細胞生理功能完整性之間尋求平衡。前2種載藥策略對紅細胞結構和功能完整性的破壞都比較大，主要利用了少部分紅細胞膜的性質。而第3種載藥策略，可更充分發揮紅細胞的優勢。本文主要涉及基于完整活紅細胞的載藥策略。
1載藥方法
1.1將藥物包封進活態紅細胞內
1.1.1低滲預膨脹法該技術主要是基于紅細胞的滲透特性。將紅細胞置于梯度低滲溶液中(例如180和120mOsm/kg)，使其達到溶血臨界點，此時細胞膜上出現200～500Å的孔洞，藥物通過孔洞進入紅細胞后再將紅細胞轉移至等滲溶液中，紅細胞恢復正常形態，膜表面孔洞關閉，將藥物保留在紅細胞內。Attia等[5]采用此法制備了載普伐他汀殼聚糖納米凝膠的紅細胞，結果顯示出良好的肝靶向能力。Harisa等[6]將紫杉醇包封進人紅細胞，包封率46.36%，紅細胞回收率75.94%。Hamidi等[7]將干擾素-2b(IFN-2b)包封進紅細胞，包封率(14.53±2.94)%，紅細胞回收率(83.61±0.49)%，結果顯示出良好的網狀內皮系統靶向能力。EryDel公司的Magnani[8]基于此方法，設計了名為“RedCellLoader™”的紅細胞載藥專用設備(中國發明專利：CN102985079A;美國發明專利：US2013101463A1)。利用該設備采用低滲預膨脹法將地塞米松-21磷酸鹽包封進紅細胞，用以治療慢性阻塞性肺病、肺囊性纖維化等疾病，目前正在美國等國家進行Ⅲ期臨床試驗。
1.1.2低滲透析法該方法同樣基于紅細胞在不同滲透壓環境下能夠發生可逆膨脹和回縮的特點，與預膨脹法不同的是，紅細胞與調節滲透壓的溶液以半透膜分隔開。在實驗室條件下，可將裝有紅細胞懸液的透析袋置于低滲溶液中，藥物預先溶解在紅細胞懸液或者低滲溶液中;紅細胞膨脹至膜表面出現孔洞，藥物通過孔洞進入紅細胞后，將低滲溶液更換為等滲溶液封閉孔洞，藥物保留在紅細胞內。Bax等[9]采用該法將腺苷脫氨酶(adenosinede⁃aminase，ADA)包封進紅細胞，用以治療腺苷脫氨酶缺陷。對1名患者進行了長達17年的臨床試驗，取得了良好的治療效果，且未產生明顯副作用。2006年，EryTech公司的Bourgeaux等[10]以此方法為基礎開發了名為“ERY-caps™”的紅細胞載藥專用設備(中國發明專利：CN101031339A;美國發明專利：US2014154797A1)，將L-天冬酰胺酶包封進紅細胞，用于治療急性淋巴細胞白血病，目前正在美國等國家進行Ⅲ期臨床試驗。
1.1.3高滲法高滲法操作簡單，將紅細胞在50%的高滲葡萄糖溶液中脫水，然后在含有藥物的低滲或者等滲溶液中重漲，使藥物順紅細胞內外的滲透壓差進入紅細胞[11]。采用高滲法制備的載嗎啡紅細胞進行家兔體內實驗，證明藥物作用時間較普通嗎啡注射液顯著延長[12];用于胸部手術后患者鎮痛[13]，以及老年患者全髖關節置換術的術后鎮痛[14]，效果良好。采用此法包載抗癌藥物甲氨蝶呤，包封率較高，體內消除時間明顯延長[15]。但高滲法的主要問題是會對紅細胞造成一定損傷。筆者在利用高滲法包封藥物時，對處理后的紅細胞進行血液成分分析，觀察到血小板計數(plateletcount，PLT)明顯升高，提示處理過程可能對紅細胞造成較大損傷，產生了血小板樣碎片。
1.1.4電穿孔法該方法的基本原理是在等滲溶液中以電擊方式誘導紅細胞膜發生滲透性的改變;跨膜電位差導致在紅細胞膜上形成孔，藥物分子從孔隙進入紅細胞中[10]。采用此法可將重組人白細胞介素-2包封進紅細胞，包封率為5%～7.5%[16];包封雙氯芬酸鈉，引入紅細胞的藥物平均濃度可達4.21mmol/L[17];包封乙醇脫氫酶(alcoholdehydroge⁃nase，ADH)和乙醛脫氫酶(aldehydedehydrogenase，ALDH)的紅細胞載體包封率和紅細胞回收率良好，單獨包封ADH和共包封兩種酶的紅細胞，體外實驗中可在70h內連續有效降解乙醇[18]。
1.1.5穿膜肽介導法He等[19]采用穿膜肽(cellpenetratingpeptides，CPP)介導的藥物內化方式，將L-天冬酰胺酶包封進紅細胞。這種載藥方式不會對紅細胞膜造成明顯傷害，具體來說是基于CPP介導的非選擇性細胞內化現象，將待包封的蛋白質藥物與低相對分子質量魚精蛋白(一種CPP)通過二硫鍵共價連接;CPP-蛋白質復合物進入紅細胞以后，二硫鍵在細胞質谷胱甘肽的作用下降解，CPP和蛋白質分離，蛋白質藥物包封在紅細胞內。
1.1.6化學物質誘導內吞法Ginn等[20]發現某些特殊結構的化學物質(例如伯胺喹)可誘導紅細胞的內吞作用，從而將藥物包封進紅細胞。采用這種方式將伯氨喹包封進紅細胞，每ml紅細胞可包封0.1～0.15mg藥物[21];包封普伐他汀，包封率可達94%，紅細胞回收率87%～93%[22]。但是該方法有一個比較突出問題，就是只能用于包封同時具有疏水和親水基團的陽離子或陰離子藥物。
1.1.7滲透脈沖法滲透脈沖法的基本原理是使紅細胞在短暫而強烈的滲透壓力作用下發生瞬時的物質交換。利用該方法將肌醇六磷酸(inositolhexaphosphate，IHP)包封進紅細胞，可制備低氧親和力的紅細胞[23]。先向紅細胞混懸液中加入二甲亞砜(DMSO)，在紅細胞內外建立高滲透壓;然后向紅細胞混懸液中迅速加入含有IHP的等滲溶液，細胞外部DMSO濃度迅速下降，在紅細胞膜兩側迅速建立滲透壓梯度。這種瞬時梯度導致水和藥物內流、細胞膨脹和膜的通透性增加。室溫下這個滲透過程持續約1s。Mosca等[24]對比了低滲透析法和DMSO滲透脈沖將IHP包封進紅細胞的包封率等參數。該法制備的紅細胞包封率高，但是1次只能處理很少數量的紅細胞(紅細胞總數的9%～25%)。
1.1.8共包封(藥物結合蛋白)法對于具有良好跨膜滲透能力的藥物來說，直接包封進紅細胞難以產生明顯的緩釋效果。研究人員將藥物結合蛋白和藥物一起包封進紅細胞。Hamidi等[25]將苯妥英和牛血清白蛋白一起包封進紅細胞，與單純包封苯妥英相比，載藥量提升了8倍，藥物釋放更加可控，且載藥細胞未產生明顯的特性改變。Biagiotti等[26]將親免素蛋白(immunophilin)FKBP12和CypA分別包封進紅細胞，使他克莫司和環孢素A的載藥量提高了一個數量級。
1.2將藥物連接到活紅細胞膜上
早期研究者的注意力多集中在將藥物包封進紅細胞內部，忽略了對紅細胞膜的利用。實際上，單個紅細胞膜表面積160μm2，也是良好的載藥平臺，而且將藥物偶聯到紅細胞膜上能在一定程度上減小對紅細胞結構和功能的損害[2]。
1.2.1化學連接20世紀80年代初，研究者們已經測試了數種將蛋白質分子與紅細胞膜上的基團共軛連接的方法，例如使用非特異性化學交聯劑戊二醛。戊二醛可連接藥物分子的氨基與紅細胞膜上的游離氨基，載藥細胞進入血液循環后，在水解酶作用下釋放藥物。用戊二醛將柔紅霉素連接到紅細胞膜上，并對14名白血病患者進行了藥代動力學和耐藥性的初步研究[27]。靜脈給藥后，藥物的峰濃度和消除率顯著低于游離柔紅霉素，且患者的耐受性較好。將鏈激酶連接到紅細胞上，連接效率可達90%，該復合物可溶解血管內的纖維蛋白凝塊[28];將巰基化的低相對分子質量肝素，通過一種偶聯試劑連接到紅細胞上，該復合物有長期抗凝和預防血栓的潛能[29]。
后來研究者們開發了特異性更強的連接方式，利用生物素-親和素系統將生物素化的化學物質連接到紅細胞膜的某些靶點上。Cowley等[30]通過不同的方法，對紅細胞膜表面的41種抗原進行了生物素化修飾，拓展了該技術的應用范圍。Magnani課題組[31]對兩種紅細胞體外生物素化的方式進行對比，借助生物素N-氫琥珀酰亞胺酯(biotinN-hydro⁃succinimideester，NHS-生物素)與紅細胞膜氨基連接，或是通過生物素酰肼氧化紅細胞膜上的誘導醛基，前者紅細胞回收率可達90%以上。該課題組后用生物素化的方式將抗Thy-1.2單克隆抗體偶聯至紅細胞，將紅細胞靶向淋巴細胞[32]。也有研究采用生物素化的方式將抗人IgM的單克隆抗體連接到紅細胞上[33]。
1.2.2紅細胞搭便車技術Brenner等[34]開發了“紅細胞搭便車”技術(redbloodcell-hitchhiking，RH)，它是將藥物納米顆粒吸附到紅細胞上，然后通過靜脈注射或者動脈血管插管的方式輸注給患者;進入血液循環后，納米顆粒由于剪切應力或與內皮細胞直接接觸而解吸附。因此該載藥方式適于將藥物靶向到注射下游的第1處毛細血管富集器官。該法可有效改善納米載體藥物肝脾攝取嚴重、體內靶向性差等問題[35]，配合臨床上使用的血管插管治療方式，可大幅度提升納米載體藥物的器官靶向能力。例如將載藥脂質體吸附到紅細胞上，靜脈注射后，在肺部富集提升40倍;用此法遞送FDA批準上市的溶栓藥物Reteplase，可有效改善小鼠肺動脈栓塞(pulmonaryembolism，PE)癥狀;配合頸動脈血管插管注射RH納米顆粒，可將超過10%的納米載體遞送到腦。RH藥物遞送系統的器官靶向能力顯著優于目前常用的親和配體方式，例如RH藥物遞送系統的肺部靶向能力，與已有20年臨床使用經驗的anti-RECAM抗體相比高約14倍;在腦血管靶向方面，目前報道效果最好的腦靶向親和配體轉鐵蛋白，也只能將注射劑量1%的藥物靶向到腦部，而RH-水凝膠納米顆粒，腦部攝取可達到12%[34]。
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但是該藥物遞送系統也存在一些問題：①藥物納米顆粒與紅細胞連接不牢固，易發生解吸附;②目前利用該系統實現心、腦等器官的靶向，需要借助動脈血管插管，因此適合急性、嚴重疾病，不適合大多數慢性、門診治療的疾病[36]。
1.2.3將治療藥物靶向到循環紅細胞在體外制備藥物-抗體/多肽復合物，然后將這種復合物注入體內，靶向連接到循環紅細胞上，能在一定程度上避免體外操作和重新輸注引發的問題。該方法能以紅細胞表面的多種抗原為靶點，例如免疫黏附受體CR1、Rh&RhAG家族蛋白質、Kell蛋白質、Band3陰離子通道蛋白、血型糖蛋白、糖轉運蛋白1(glu⁃cosetransporter1，Glut1)家族、Dombrock血型系抗原和其他的高表達抗原[36]。
將組織型纖溶酶原激活劑(tissueplasminogenactivator，tPA)共軛連接到CR1的單克隆抗體上，制備anti-CR1/tPA復合物，該復合物進入血液循環后連接到紅細胞上，可賦予紅細胞纖維蛋白溶解活性[37]。在體外實驗中，紅細胞連接該復合物可引起90%的纖維凝塊溶解，在人CR1轉基因小鼠體內實驗中，該復合物可有效加速肺栓塞的裂解。糖蛋白A(glycoproteinA，GPA)在人類紅細胞上的表達都超過5×105拷貝數，高于CR1;將tPA[38]和尿激酶纖溶酶原激活劑(urokinaseplasminogenactivator，uPA)[39]分別與對小鼠GPA具有特異性的單鏈抗體可變片段(single-chainvariablefragment，scFv)融合，得到抗GPAscFv/PA復合物和scFv/uPA-T復合物，體內實驗證明這兩種復合物都具有出色的血栓預防功能。
類似的載藥方法還可用于清除體內的病原體。用紅細胞表面抗原CR1的抗體-C3b和一種病原體的抗體共軛結合得到復合物-雙特異性單克隆抗體復合物，該復合物可同時特異性結合紅細胞表面抗原CR1和病原體;向實驗動物注射模型病原體，繼而注射該復合物，發現其可高效實現紅細胞介導的病原體清除[40]，例如二硝基酚-牛γ-球蛋白(dinitrophenol-bovineγglobulin，DNP-BGG)[41]、大腸桿菌[42]和馬爾堡病毒[43]，而且紅細胞不會被裂解或吞噬。
2紅細胞載體藥物的優勢
2.1改善藥物靶向性
某些試劑，如雙(磺基琥珀)辛二酸酯[bis(sulfo⁃succinimidyl)suberate，BS3]和ZnCl2，可使紅細胞表面抗原性質發生改變，模擬細胞衰老過程，使紅細胞靶向到巨噬細胞[44]。較早的關于紅細胞巨噬細胞靶向性的報道見于20多年前，Magnani等[45]采用上述方法將包載1型人類免疫缺陷病毒(humanim⁃munodeficiencyvirustype1，HIV-1)、貓免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiencyvirus，FIV)等逆轉錄病毒抑制劑的紅細胞進行膜處理后靶向到巨噬細胞。
除了對巨噬細胞具有天然靶向性之外，紅細胞還可通過一些處理實現其他部位的靶向性。繆婉琳等[46]將Fe3O4納米顆粒包封進紅細胞，制備磁化紅細胞和磁化載多柔比星紅細胞。在外加磁場的引導下，磁化的載多柔比星紅細胞可準確靶向腫瘤細胞。Wang等[47]將Fe3O4納米顆粒外包被光敏劑二氫卟吩e6(chlorine6，Ce6)并連接PEG，然后將該復合物通過生物素化的方式連接到紅細胞膜上，紅細胞內包封多柔比星，制備了載多柔比星的紅細胞-磁性納米顆粒-Ce6-PEG磁響應藥物遞送系統。Gao等[48]將光敏劑Ce6連接到紅細胞膜，低功率光照使Ce6產生單線態氧，有效破壞紅細胞膜，可實現對包封在紅細胞內的藥物光響應釋放。Xia等[49]將胰島素包封進紅細胞，再通過生物素化的方法將葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOx)修飾到紅細胞膜上，制備糖響應的載胰島素紅細胞。血液中葡萄糖在GOx作用下分解成葡萄糖酸和過氧化氫，后者裂解紅細胞釋放胰島素，實現血糖調控。
2.2血液循環中的生物反應器
在紅細胞中包載酶，可作為血液循環中的生物反應器。例如將L-天冬酰胺酶包封進紅細胞，底物天冬酰胺進入紅細胞被酶降解，從而清除血液循環中的天冬酰胺[10]。已有數種解毒酶利用類似的方法被包封進紅細胞。例如可將硫氰酸酶和有機硫代磺酸鹽包封進紅細胞，用于氰化物解毒[50];或者將重組磷酸三酯酶包封進紅細胞，磷酸三酯酶可將對氧磷水解為毒性較小的4-硝基苯酚和二乙基磷酸酯，在小鼠體內可顯著對抗對氧磷的致死作用[51]。
2.3實現藥物的超長緩釋
正常人紅細胞的壽命為100～120d，如果能夠充分利用這個特點，可制備超長循環的藥物載體。將藥物直接包封進紅細胞，可在一定程度上延長藥物的循環半衰期。例如將甲氨蝶呤包封進紅細胞，游離甲氨蝶呤消除半衰期為(3.9±0.8)h，載甲氨蝶呤的紅細胞消除半衰期為(13.5±2.0)h[15]。但是這種將可滲透過膜的脂溶性藥物直接包封進紅細胞，任由其滲透出紅細胞膜的方法，顯然不能充分利用紅細胞的長循環優勢。
為此，Magnani團隊提出了磷酸化前藥的載藥策略。該策略是將磷酸化前藥包封進紅細胞內，在紅細胞內酶(例如5′-核苷酸酶)的作用下，轉變為活性產物釋放出細胞，從而實現藥物的緩釋。自1988年起，他們分別將5-氟-2′-脫氧尿苷[52]、2′，3′-雙脫氧胞苷[53]、疊氮胸苷[54]、氟達拉濱[55]等藥物的磷酸化前藥包封進紅細胞，使這些藥物的半衰期得到了顯著的延長。該團隊最成功的嘗試，是將地塞米松的非擴散性前藥地塞米松-21磷酸鹽包封進紅細胞，在相關酶的作用下，轉變為可滲透性的地塞米松釋放出紅細胞。單次處理50～70ml血液并回輸，可在患者體內維持治療濃度達3～4周[8]，目前正在美國等國進行Ⅲ期臨床試驗。
3結語
1973年Ihler等發表以紅細胞包載酶的第1篇論文，其后研究者們嘗試了用紅細胞遞送各類藥物。這些有益嘗試拓展了紅細胞載體藥物的應用范圍。但是目前仍有一些需要克服的問題：①載藥紅細胞的儲存和質量控制困難;②載藥過程會損害紅細胞結構和功能的完整性，帶來一些局部和全身的副作用[56]。隨著研究深入，相信這些問題可被逐一克服，紅細胞載體藥物必定能給藥學發展帶來重大變革。
SCISSCIAHCI
