發(fā)布時(shí)間：2019-11-09所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 背景：人多能干細(xì)胞源神經(jīng)細(xì)胞移植治療帕金森病的研究已經(jīng)取得極大進(jìn)展，進(jìn)入了亞臨床研究階段，但依然有許多問題亟待解決，其中一個(gè)問題是分化的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性可以引起移植后宿主體內(nèi)腫瘤形成、異動癥的發(fā)生，給患者帶來了潛在的、不可預(yù)估的安全風(fēng)險(xiǎn)
背景：人多能干細(xì)胞源神經(jīng)細(xì)胞移植治療帕金森病的研究已經(jīng)取得極大進(jìn)展，進(jìn)入了亞臨床研究階段，但依然有許多問題亟待解決，其中一個(gè)問題是分化的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性可以引起移植后宿主體內(nèi)腫瘤形成、異動癥的發(fā)生，給患者帶來了潛在的、不可預(yù)估的安全風(fēng)險(xiǎn)。
目的：總結(jié)人多能干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的現(xiàn)狀、分化方案設(shè)計(jì)的原理、誘導(dǎo)流程和異質(zhì)性分化的研究現(xiàn)狀，為其移植治療實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化奠定理論基礎(chǔ)。
方法：英文檢索詞為“iPSC AND Parkinson’s Disease，Induced pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease，ES cells AND Parkinson’s Disease，Embryonic stem cells AND Parkinson’s Disease，Pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease”，中文檢索詞為“多能干細(xì)胞 AND 帕金森病，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 AND 帕金森病，胚胎干細(xì)胞 AND 帕金森病”，由第一作者檢索 1980 至 2018 年 PubMed 數(shù)據(jù)庫、中文中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫和萬方數(shù)據(jù)庫，查閱近年誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞源神經(jīng)元移植治療帕金森病的相關(guān)文獻(xiàn)，最終保留 46 篇文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)。
結(jié)果與結(jié)論：多能干細(xì)胞應(yīng)用各種不同體外誘導(dǎo)分化方案，可誘導(dǎo)分化為 A9 多巴胺能神經(jīng)元，移植后可以促進(jìn)帕金森病模型動物的行為學(xué)及肢體功能的恢復(fù)。然而目前的分化方案產(chǎn)物中除了可以分化為 A9 多巴胺能神經(jīng)元外，還包括 A10 多巴胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元等不同的神經(jīng)元，尚無一種分化方案可以達(dá)到均一性分化。優(yōu)化多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化條件，同質(zhì)性分化為 A9 多巴胺能神經(jīng)元可以進(jìn)一步改善帕金森病模型動物的行為學(xué)表現(xiàn)，促進(jìn)該細(xì)胞療法的臨床轉(zhuǎn)化。
關(guān)鍵詞：帕金森病;誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞;多巴胺能神經(jīng)元;細(xì)胞分化;細(xì)胞移植;異質(zhì)性;干細(xì)胞;國家自然科學(xué)基金
0 引言 Introduction
帕金森病是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要發(fā)病機(jī)制為紋狀體區(qū)多巴胺遞質(zhì)降低，臨床癥狀包括靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩和姿勢平衡障礙等運(yùn)動癥狀[1]，以及嗅覺減退、快動眼期睡眠行為異常、便秘和抑郁等非運(yùn)動癥狀[2]。最明顯的病理特征為黑質(zhì)致密部A9多巴胺神經(jīng)元選擇性變性和細(xì)胞內(nèi)Lewy小體聚集，但A9多巴胺神經(jīng)元選擇性變性的原因尚不清楚[3]。隨著人口老齡化和壽命的延長，帕金森病的發(fā)病率不斷增加，中國65歲以上人群患病率約1.7%，約260多萬帕金森病患者，幾乎占了全世界患者的一半，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)[4]。
帕金森病的藥物治療已經(jīng)有50多年的歷史，藥物以左旋多巴或多巴胺能受體激動劑的形式作用于功能失調(diào)的多巴胺能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來減輕運(yùn)動障礙。這些治療在疾病早期非常有效，但最終會產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如運(yùn)動并發(fā)癥(癥狀波動、異動癥)，幻覺和一系列中樞多巴胺受體的非生理刺激相關(guān)的行為和精神癥狀[5]。在疾病后期藥物無法控制運(yùn)動并發(fā)癥的情況下，腦深部電刺激、皮下注射阿撲嗎啡、卡比多巴-左旋多巴腸凝膠連續(xù)輸注等輔助療法可以作為備選治療手段[6]。這些輔助療法對控制運(yùn)動并發(fā)癥有一定療效，但其局限性也不容忽視，如對非運(yùn)動癥狀作用有限，相關(guān)不良事件、感染、腦血腫以及心理和行為異常等發(fā)生率較高[7-8]。綜上所述，藥物治療和設(shè)備輔助治療僅僅可以減輕疾病癥狀，不能治愈或減緩疾病進(jìn)程。
鑒于其流行病學(xué)重要性，帕金森病可被視為一個(gè)公共衛(wèi)生問題，其表現(xiàn)包括社會、家庭、經(jīng)濟(jì)、甚至法律問題，并對醫(yī)療保健系統(tǒng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)影響[9]。因此，需要尋找新的療法以治愈或延緩帕金森病的進(jìn)展。最理想的療法是替代已經(jīng)失神經(jīng)支配的多巴胺能神經(jīng)元，重建生理性多巴胺輸送系統(tǒng)。
胚胎腹側(cè)中腦組織中含有多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞，由于諸多問題，移植該組織細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療帕金森病難以大規(guī)模開展。人多能干細(xì)胞因其擁有自我更新和分化成多種人類細(xì)胞類型的潛能，為帕金森病細(xì)胞治療提供了可能，文章綜述了細(xì)胞替代療法發(fā)展與現(xiàn)狀，介紹了中腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育的前后模式和背腹模式。人多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化方案模擬人胎腦正常中腦發(fā)育模式來設(shè)計(jì)，經(jīng)過神經(jīng)干細(xì)胞、中腦多巴胺能祖細(xì)胞、終末細(xì)胞成熟，其可分化為A9多巴胺能神經(jīng)元，重建生理性多巴胺輸送系統(tǒng)，移植后可以促進(jìn)帕金森病模型動物的肢體功能恢復(fù)[10]。
在體內(nèi)，細(xì)胞分化受到局部分泌的形態(tài)發(fā)生素和生長因子的調(diào)節(jié)，且分化過程需要各種形態(tài)發(fā)生素在時(shí)間和空間上精密調(diào)控，其可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)途徑的激活，通過激活特定的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞分化。由于目前尚未完全掌握相關(guān)分化的機(jī)制，在體外分化產(chǎn)生是多巴胺能神經(jīng)元和其他非典型的細(xì)胞類型如丘腦底核的5-羥色胺神經(jīng)元的混合物。多巴胺能神經(jīng)元包括3個(gè)亞型：A8，A9和A10亞群，但宿主腦內(nèi)只有產(chǎn)生A9多巴胺能神經(jīng)元才能整合到去神經(jīng)支配的紋狀體，促進(jìn)肢體運(yùn)動功能恢復(fù)。這種異質(zhì)性可以引起移植后宿主體內(nèi)腫瘤形成、異動癥的發(fā)生，給患者帶來了潛在的、不可預(yù)估的安全風(fēng)險(xiǎn)。目前研究熱點(diǎn)集中在如何優(yōu)化多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞，對終末分化的異質(zhì)性現(xiàn)象尚未引起足夠重視。文章分析總結(jié)了異質(zhì)性分化帶來的后果及產(chǎn)生該現(xiàn)象可能機(jī)制，歸納了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展，提出了解決該問題的可能改善策略，為將來同質(zhì)性分化以及移植效果的優(yōu)化提供了參考。
1 資料和方法 Data and methods
1.1 資料來源 英文檢索詞“iPSC AND Parkinson’s Disease ， Induced pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease ， ES cells AND Parkinson’s Disease ， Embryonic stem cells AND Parkinson’s Disease ， Pluripotent stem cells AND Parkinson’s Disease;中文檢索詞“多能干細(xì)胞 AND 帕金森病，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 AND 帕金森病，胚胎干細(xì)胞 AND 帕金森病”，由第一作者在2018年3月進(jìn)行檢索，檢索1980 至2018年P(guān)ubMed 數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫和萬方數(shù)據(jù)庫，查閱近年誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞源神經(jīng)元移植治療帕金森病的相關(guān)文獻(xiàn)，最終保留46篇文獻(xiàn)。
1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) ①內(nèi)容相關(guān)程度高;②具有原創(chuàng)性，且觀點(diǎn)明確，論據(jù)可靠的文獻(xiàn);③內(nèi)容相近的選擇近期或在權(quán)威雜志發(fā)表的文獻(xiàn)。
1.3 質(zhì)量評估 共收集到581篇相關(guān)文獻(xiàn)。閱讀標(biāo)題和摘要進(jìn)行初篩，最后保留46篇相關(guān)度高，且符合核心內(nèi)容的文章進(jìn)行綜述。文獻(xiàn)篩選流程見圖1。
2 結(jié)果 Results
2.1 帕金森病的細(xì)胞替代療法現(xiàn)狀 胚胎腹側(cè)中腦組織中含有多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞，其移植治療帕金森病患者的臨床研究已經(jīng)開展了30多年。盡管臨床結(jié)局好壞不一，但這些臨床研究已證明細(xì)胞替代療法的確是一種非常有希望的治療策略，成為持續(xù)的研究熱點(diǎn)[10]。然而由于倫理問題，難以得到大量的胎兒中腦組織，存在移植物質(zhì)量參差不齊，難以標(biāo)準(zhǔn)化等問題，胚胎腹側(cè)中腦細(xì)胞移植很難大規(guī)模開展。
人多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells， hPSCs)包括人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)，均具有自我更新和分化成多種人類細(xì)胞類型(包括中腦多巴胺能神經(jīng)元)的潛能[11]。因此，人多能干細(xì)胞為細(xì)胞替代療法的開展提供了有價(jià)值的資源[12-13]。通常情況下，人多能干細(xì)胞在體內(nèi)分化的不可控性，并不適合直接移植。此外，神經(jīng)干細(xì)胞傾向于分化為中間神經(jīng)元類型和星形膠質(zhì)細(xì)胞，體外很難產(chǎn)生足夠數(shù)量的多巴胺能神經(jīng)元，因此從治療的安全性和有效性綜合考慮，移植已經(jīng)定向的多巴胺能祖細(xì)胞更具可行性[14]。Kikuchi小組[15]的實(shí)驗(yàn)顯示無飼養(yǎng)層和無血清條件下由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化衍生的多巴胺能神經(jīng)元，在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP)損傷的帕金森病猴體內(nèi)存活6個(gè)月。該報(bào)道支持人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞對未來臨床試驗(yàn)的治療潛力。Kirkeby 小組[16]則使用優(yōu)化的方案分化人胚胎干細(xì)胞，將衍生的多巴胺能神經(jīng)元移植入紋狀體內(nèi)，能改善6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的半帕金森病大鼠運(yùn)動功能。同時(shí)多個(gè)研究小組證實(shí)，通過特定的誘導(dǎo)方案可將人多能干細(xì)胞分化為A9 多巴胺能神經(jīng)元[17-19]。移植后的多巴胺能神經(jīng)元可以在動物模型腦內(nèi)存活、神經(jīng)支配，促進(jìn)功能修復(fù)[20-21]，而沒有產(chǎn)生腫瘤[22]。2017年中國科學(xué)院周琪院士主持的 “人胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)祖細(xì)胞治療帕金森病”的臨床前期研究在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院正式開展，表明干細(xì)胞替代療法已經(jīng)十分接近臨床。
2.2 當(dāng)前人多能干細(xì)胞分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)方案的設(shè)計(jì)基本原理及機(jī)制
2.2.1 中腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育的前后模式和背腹模式 在胚胎發(fā)育過程中，發(fā)育模式和細(xì)胞命運(yùn)特異性分化受到局部分泌的形態(tài)發(fā)生素和生長因子的調(diào)節(jié)。神經(jīng)的形成是一個(gè)發(fā)展的過程。它從外胚層開始，神經(jīng)上皮層或神經(jīng)板折疊形成神經(jīng)管，大腦和脊髓從該神經(jīng)管發(fā)育而來。神經(jīng)管沿著延喙尾軸和背腹軸生長，此發(fā)育模式在時(shí)間和空間上受沿前后模式和背腹模式軸分布的形態(tài)發(fā)生素濃度梯度的協(xié)調(diào)控制。此過程中，細(xì)胞分化由形態(tài)發(fā)生因子和鄰近細(xì)胞分泌的信號分子誘導(dǎo)[23]。影響前后模式的形態(tài)發(fā)生素包括成纖維細(xì)胞生長因子、 WNT和視黃酸，經(jīng)典WNT/ β-catenin信號通路在其中扮演了關(guān)鍵角色。影響背腹模式的成分包括WNT、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和音猬因子，SHH信號通路起到了決定性作用。沿前后模式和背腹模式軸分布的形態(tài)發(fā)生素濃度梯度限定了轉(zhuǎn)錄密碼和特定區(qū)域神經(jīng)前體細(xì)胞的身份，見圖2。形態(tài)發(fā)生素濃度輕微的變化就可以引起細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變[24]。這兩種模式是體外方案中調(diào)控WNT信號通路和SHH信號通路可以決定中腦神經(jīng)前體表型的理論依據(jù)。
2.2.2 分化方案的步驟及設(shè)計(jì)原理 人多能干細(xì)胞分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)方案模擬人胎腦正常中腦發(fā)育模式，幾乎所有分化方案都圍繞下述原理和機(jī)制來設(shè)計(jì)。
第一階段為神經(jīng)誘導(dǎo)，即外胚層細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的分化。該分化受到屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)蛋白超家族的骨形態(tài)發(fā)生蛋白的調(diào)控。因此，通過抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白和TGF-β/ SMAD信號傳導(dǎo)可啟動神經(jīng)誘導(dǎo)[25]。在分化方案的起始階段，采用“雙SMAD抑制劑”策略保證神經(jīng)方向分化。 SB431542和NOGGIN分別抑制 Lefty/Activin/TGFβ/ SMAD通路和BMP/SMAD信號通路，使干細(xì)胞退出多能干狀態(tài)，分化為神經(jīng)干細(xì)胞，以確保外胚層既不分化為表皮組織，又不分化為內(nèi)、中胚層組織[24]。
第二階段為中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞的定型和區(qū)域化。神經(jīng)干細(xì)胞分化為中腦多巴胺能祖細(xì)胞。中腦正常發(fā)育定型有兩個(gè)信號中心，中腦腹側(cè)底板(floor plate， FP)的Shh-Foxa2信號回路和中、后腦交界處峽部組織 (isthmic organizer，IsO)的OTX2-WNT1-Lmx1a/Msx1 信號回路。前者決定了神經(jīng)祖細(xì)胞的腹側(cè)身份，后者決定了其后端側(cè)身份，這兩個(gè)信號回路之間互相作用，產(chǎn)生了微妙的動態(tài)平衡，決定了中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞正確的身份。在此階段，添加音猬因子(SHH)或SHH激動劑可以促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的腹側(cè)化，添加糖原合成酶激酶3β抑制劑CHIR99021使WNT1-Lmx1a/Msx信號通路激活，促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的后端化。上述這兩種效應(yīng)均呈劑量依賴性，確保神經(jīng)干細(xì)胞不分化為前腦、后腦和脊髓等其他區(qū)域的神經(jīng)祖細(xì)胞[26-27]。
第三階段為中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞終末分化，確保分化為成熟的中腦多巴胺能神經(jīng)元。目前的分化方案均添加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等，促進(jìn)中腦多巴胺能神經(jīng)元的成熟[28]。中腦多巴胺能神經(jīng)元分為A8、A9、A10亞群，所有中腦多巴胺能神經(jīng)元均起源于中腦底板室?guī)^(qū)的神經(jīng)祖細(xì)胞，但祖細(xì)胞階段如何決定多巴胺能神經(jīng)元亞群表型和功能的多樣性，以及相關(guān)分子機(jī)制仍知之甚少。
2.2.3 目前誘導(dǎo)方案的研究進(jìn)展 早期分化方案產(chǎn)生大量的TH+ 神經(jīng)元，但沒有共表達(dá)中腦多巴胺能神經(jīng)元的兩種轉(zhuǎn)錄因子FOXA2和LMX1A。后續(xù)方案在正確指定中腦多巴胺能神經(jīng)元的基礎(chǔ)上，用SHH和FGF8處理后表達(dá)出LMX1A，得到的培養(yǎng)物含有50%TH+ 神經(jīng)元，其中大部分共表達(dá)中腦多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記，如 LMX1B、NURR1、PITX3和DAT。還有方案添加GSK3β 抑制劑，其可有效產(chǎn)生人多能干細(xì)胞源中腦多巴胺能神經(jīng)元，培養(yǎng)物中有80%FOXA2+ 細(xì)胞和75%TH+ 細(xì)胞[29]。最近一項(xiàng)研究由Kirkeby小組[20]提出，分階段的應(yīng)用 FGF8b可修飾人胚胎干細(xì)胞衍生的多巴胺能祖細(xì)胞向尾部腹側(cè)中腦細(xì)胞分化。
2.3 中腦多巴胺能神經(jīng)元亞型分化的機(jī)制研究現(xiàn)狀 中腦多巴胺能神經(jīng)元包括3個(gè)亞型：A8，A9和A10亞群。A8 亞群位于紅核后區(qū)(retrorubral field，RrF);A9亞群位于黑質(zhì)致密部(substantia nigra compacta，SNc);A10亞群位于腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)。當(dāng)前對A9、A10亞型多巴胺能神經(jīng)元的起源及功能研究較多，SNc/A9多巴胺能神經(jīng)元主要表達(dá)Aldh1a1和Girk2/ KCNJ6，而VTA/A10神經(jīng)元主要表達(dá)鈣結(jié)合蛋白Calb1， Calb2(calbindin 1和2)和Cck(膽囊收縮素)。這3種亞型的多巴胺能神經(jīng)元纖維分別投射到不同腦區(qū)，產(chǎn)生不同的生理功能[30]。僅有黑質(zhì)致密部A9多巴胺能神經(jīng)元變性引起帕金森病。A9和A10神經(jīng)元共同起源于中腦底板室?guī)晃恢玫姆派錉钅z質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)多巴胺能祖細(xì)胞早期分化為A9神經(jīng)元，晚期分化為A10神經(jīng)元。上述現(xiàn)象提示中腦多巴胺能神經(jīng)元亞型的決定因素是在神經(jīng)祖細(xì)胞形成之后的發(fā)育階段中。
體內(nèi)動物發(fā)育模型中，調(diào)控中腦多巴胺能神經(jīng)元亞群的發(fā)育分子機(jī)制歸納為以下6個(gè)方面：①SOX6 和 OTX2協(xié)調(diào)作用，調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞，產(chǎn)生不同的亞群;其中SOX6對神經(jīng)元亞型分化的調(diào)控作用已經(jīng)在大腦皮質(zhì)中間神經(jīng)元和胃多巴胺能神經(jīng)元等神經(jīng)發(fā)育中得到體現(xiàn)。SOX6是第一個(gè)調(diào)控腸神經(jīng)系統(tǒng)單一多巴胺能神經(jīng)元亞型發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子[31-32];②Pitx3和En1協(xié)調(diào)作用，調(diào)控正在有絲分裂的多巴胺能神經(jīng)元，產(chǎn)生不同的亞群;③Rspo2調(diào)節(jié)WNT信號通路，減輕黑質(zhì)A9神經(jīng)元的易損性;④Ahd2具有解毒功能，抵抗黑質(zhì)A9神經(jīng)元變性，保護(hù)神經(jīng)元;⑤Mest通過WNT信號通路影響黑 質(zhì) A9 神經(jīng)元發(fā)育;⑥ NeuroD1 和 NeuroD6 調(diào) 控 VTA/A10神經(jīng)元的發(fā)生。目前分化方案主要是集中在提高神經(jīng)多巴胺能祖細(xì)胞的表達(dá)階段，對如何調(diào)控祖細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元亞型的研究較少[33-34]。
2.4 人多能干細(xì)胞向中腦多巴胺能神經(jīng)分化過程中的異質(zhì)性研究進(jìn)展 盡管人多能干細(xì)胞替代療法治療帕金森病已經(jīng)邁出了進(jìn)入臨床階段的第一步，但目前仍然存在諸多需要進(jìn)一步優(yōu)化解決的問題，在體內(nèi)，中腦神經(jīng)管室?guī)е械纳窠?jīng)干細(xì)胞放射遷移至中間帶，在此發(fā)育為神經(jīng)囊胚，繼續(xù)遷移至邊緣帶發(fā)育為A9多巴胺能神經(jīng)元，并正切遷移至黑質(zhì)致密部，該部位細(xì)胞類型一致，呈現(xiàn)“均一性”。這個(gè)過程需要各種成形素在時(shí)間和空間上精密調(diào)控才能完成[35]。在體外，尚無分化方案能達(dá)到如此“均一性”分化。雖然在過去幾年中，人多能干細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)性多巴胺能神經(jīng)元已取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[36-37]，產(chǎn)生的仍是多巴胺能神經(jīng)元和其他非典型的細(xì)胞類型的混合物[11，38-39]。這種異質(zhì)性可以引起移植后宿主體內(nèi)腫瘤形成、異動癥的發(fā)生，給患者帶來了潛在的、不可預(yù)估的安全風(fēng)險(xiǎn)[40]。目前大多數(shù)的分化方案，獲得SNc/A9多巴胺能神經(jīng)元的效率多在40%-50%之間，最高達(dá)到 75%[18]。綜上，如果要解決這些難點(diǎn)，均無法回避一個(gè)核心問題，即現(xiàn)有的分化方案并不十分完美，人多能干細(xì)胞源多巴胺能神經(jīng)分化產(chǎn)物中存在“異質(zhì)性”，有進(jìn)一步優(yōu)化的必要性。
目前的研究熱點(diǎn)集中在除中腦多巴胺能神經(jīng)元以外的其他類型細(xì)胞鑒定、產(chǎn)生原因和如何清除等方面。研究顯示，在目前不斷優(yōu)化的通用方案調(diào)控下，分化產(chǎn)物中其他類型細(xì)胞主要是丘腦底核的5-羥色胺神經(jīng)元[11，17，39-40]，主要原因是目前認(rèn)定的中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞既可以產(chǎn)生中腦多巴胺能神經(jīng)元，又可以產(chǎn)生 5-羥色胺神經(jīng)元。Xia等[11]建立了擁有酪氨酸羥化酶 (TH)-RFP(紅色熒光蛋白)報(bào)道基因的人胚胎干細(xì)胞系，使用這個(gè)TH-RFP報(bào)道細(xì)胞系能夠從異質(zhì)培養(yǎng)物中純化中腦多巴胺樣神經(jīng)元。Nolbrant等[17]提供了一個(gè)詳細(xì)的 16 d分化方案，以獲得高純度的腹側(cè)中腦多巴胺祖細(xì)胞，用于在動物模型中的大腦內(nèi)移植，該方案有助于在不同實(shí)驗(yàn)室和各種人胚胎干細(xì)胞系統(tǒng)中實(shí)施。Samata 等[39]表示人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的供體細(xì)胞不可避免有致瘤性或異質(zhì)細(xì)胞。為了消除這些異質(zhì)細(xì)胞，已經(jīng)開發(fā)了使用針對特定標(biāo)記物如CORIN或ALCAM抗體的細(xì)胞分選，但是這兩種標(biāo)記物對于腹側(cè)中腦都不是特異性的。實(shí)驗(yàn)小組對表達(dá)CORIN和LMX1A陽性細(xì)胞采用雙重選擇策略，并報(bào)道細(xì)胞表面標(biāo)記LRTM1以富集中腦多巴胺能祖細(xì)胞。當(dāng)移植到6-羥基多巴胺損傷大鼠體內(nèi)時(shí)，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的LRTM1+ 細(xì)胞在體內(nèi)存活并分化成中腦多巴胺能神經(jīng)元，運(yùn)動行為顯著改善且沒有腫瘤形成。Kee等[40]運(yùn)用單細(xì)胞分析揭示分化的多巴胺和丘腦底核神經(jīng)元譜系之間的密切關(guān)系，表示單細(xì)胞 RNA-seq可以重建LMX1A+神經(jīng)元發(fā)生發(fā)展，同時(shí) LMX1A+ 群包含不同的中腦多巴胺和STN譜系，其中 STN和中腦多巴胺譜系相關(guān)但又有截然不同的轉(zhuǎn)錄因子譜，應(yīng)用不同的標(biāo)記可以幫助優(yōu)化人胚胎干細(xì)胞衍生的中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞的分化。目前正在尋找特異性更強(qiáng)的中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞抗體標(biāo)記物或熒光標(biāo)記的報(bào)道基因配合流式細(xì)胞儀篩選，以清除分化產(chǎn)物中的5-羥色胺神經(jīng)元[11，20，40-41]。
然而，分化異質(zhì)性的另一方面，由中腦多巴胺能神經(jīng)元不同亞群引起的異質(zhì)性尚未引起足夠重視。體外培養(yǎng)和體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，在同一分化方案、同一移植宿主中，人多能干細(xì)胞可以同時(shí)分化SNc/A9和VTA/A10 亞型兩種多巴胺能神經(jīng)元[17-18，41]。
3 討論 Discussion
對帕金森病患者而言，并非所有中腦的多巴胺能神經(jīng)元都有效。帕金森病動物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SNc/A9和 VTA/A10多巴胺能神經(jīng)元纖維保持發(fā)育時(shí)的投射傾向， A9多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)纖維投射至紋狀體背外側(cè)， A10多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)纖維投射至額葉皮質(zhì);只有黑質(zhì)致密部的A9多巴胺能神經(jīng)元移植才能在宿主體內(nèi)重新建立廣泛的終端神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，整合去神經(jīng)支配的紋狀體，促進(jìn)肢體運(yùn)動功能恢復(fù)[17]。
解決策略一：尋找可以特異性分化為A9多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記物，之后對神經(jīng)祖細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀篩選。Sundberg小組[42]采用流式細(xì)胞術(shù)除去不需要的細(xì)胞類型并富集中腦多巴胺能神經(jīng)元或其亞型。從中腦底板方案分化的人多能干細(xì)胞群體中分選 NCAM+ CD29low細(xì)胞以去除非神經(jīng)致瘤細(xì)胞并富集 FOXA2+ ，LMX1A+ 和TH+ 神經(jīng)元，這些細(xì)胞的移植促進(jìn)了帕金森動物模型的行為恢復(fù)。Doi小組[21]用CORIN分選，移植表達(dá)中腦多巴胺標(biāo)記FOXA2、LMX1A的誘導(dǎo)細(xì)胞，其在6-羥基多巴胺損傷的大鼠體內(nèi)存活并誘導(dǎo)行為恢復(fù)而沒有腫瘤形成。但是，一方面目前尚未找到能產(chǎn)生中腦多巴胺能神經(jīng)元的特異性神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記物[43]，離臨床實(shí)踐仍有較遠(yuǎn)的距離。另一方面流式細(xì)胞儀的篩選尚有許多需要進(jìn)一步解決的問題，如標(biāo)記的方法是否影響細(xì)胞后續(xù)的培養(yǎng)，細(xì)胞是否能夠耐受長時(shí)間接觸氧氣和二氧化碳，機(jī)器的無菌情況等各個(gè)方面，限制了廣泛的臨床使用。
解決策略二：精細(xì)地調(diào)整分化方案，針對性的提高 A9多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)量，可以從根本上解決異質(zhì)性問題。Fasano小組[44]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)誘導(dǎo)期間使用高水平的 SHH對于底板特征是關(guān)鍵的;Andersson小組[45]證實(shí) WNT/β-catenin信號傳導(dǎo)是中腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育中的必需途徑;在實(shí)驗(yàn)中加入GSK3β抑制劑可以有效產(chǎn)生人多能干細(xì)胞衍生的中腦多巴胺能神經(jīng)元，其中含 80%FOXA2+ 細(xì)胞和75%TH+ 細(xì)胞[43，46]。Doi小組[21]研究使用層粘連蛋白511-E8在中腦底板誘導(dǎo)期間促進(jìn)人多能干細(xì)胞衍生細(xì)胞的黏附。最近一項(xiàng)研究中，Kirkeby 小組[20]應(yīng)用一組預(yù)測性標(biāo)記物，可幫助改進(jìn)分化方案并改善基于人胚胎干細(xì)胞治療帕金森病模型的移植效果，人胚胎干細(xì)胞衍生的多巴胺能祖細(xì)胞的共同標(biāo)記物與移植結(jié)果相關(guān)性小，而尾部的中腦標(biāo)記物與移植后的多巴胺能神經(jīng)元在體內(nèi)的產(chǎn)量具有相關(guān)性，同時(shí)在誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向多巴胺能祖細(xì)胞分化過程中分階段應(yīng)用 FGF8b，可修飾人胚胎干細(xì)胞衍生多巴胺能祖細(xì)胞向尾部腹側(cè)中腦細(xì)胞分化。以上分化方案設(shè)計(jì)重點(diǎn)均集中在通過各種手段提高中腦多巴胺能祖細(xì)胞的表達(dá)[17，24，36]。但是目前對如何定向調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)來提高A9 多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)量及機(jī)制仍然知之甚少，亟待更加深入研究。
期刊推薦：《中國組織工程研究》雜于1997年創(chuàng)辦，發(fā)表組織工程研究中關(guān)于干細(xì)胞培養(yǎng)與移植、組織構(gòu)建、材料生物相容性評價(jià)(天然或合成材料與納米粒子、人工材料植入體、植入器官及外源性細(xì)胞)、計(jì)算機(jī)輔助骨外科技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)及臨床研究，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和循證醫(yī)學(xué)研究的文章，發(fā)表中國組織工程研究領(lǐng)域一流水平的學(xué)術(shù)、技術(shù)創(chuàng)新成果。有投稿需求的，可以直接與期刊天空在線編輯聯(lián)系。
