發布時間：2019-08-07所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：利用室內流水式粘油礫石柱模擬實際環境中的海底重燃油,研究了重燃油污染的孔隙水對成年海膽繁殖力、配子質量及子代胚胎發育的影響. 結果表明,暴露結束后(7d),暴露組海膽的排配子率顯著降低(P=0.033),同時雌海膽繁殖力也顯著降低(P=0.036,(195791781147
摘要：利用室內流水式粘油礫石柱模擬實際環境中的海底重燃油,研究了重燃油污染的孔隙水對成年海膽繁殖力、配子質量及子代胚胎發育的影響. 結果表明,暴露結束后(7d),暴露組海膽的排配子率顯著降低(P=0.033),同時雌海膽繁殖力也顯著降低(P=0.036,(1957917±811471)個卵細胞);卵細胞的直徑和精子的受精能力并未受到海底重燃油的影響.子代繼續暴露 48h,發現親代暴露加劇了子代胚胎畸形程度,表明親代暴露的毒性可傳遞給子代.進一步利用整合毒性指數(ITI)檢測毒性傳遞的性別差異發現,與母本效應相比(24 和 48h 子代的 ITI 分別為 0.54~1.45 和 1.1~2.57),父本效應(24 和 48h 子代的 ITI 分別為 0.82~1.95 和 1.89~4.04)在毒性傳遞過程中起著關鍵作用.
關鍵詞：海底重燃油;孔隙水;親本效應;海膽;早期發育
1970~2016 年間,世界范圍內,發生了超過 1000 起船舶溢油事故,其中絕大多數事故(81%)為小型船舶溢油事故(即溢油量<7t)[1].中小型船舶溢油事故泄漏的油品往往是重燃油(HFO),其導致的 HFO 溢出量占 HFO 總溢出量的 80%以上[2].HFO 是一種原油精煉產品.HFO 黏度大(15℃運動黏度 5000~ 30000mPa·s),分散和自然降解十分困難.在風浪作用下,HFO 可以出現在距溢油事故發生地點相當遠的地方,使海岸線和敏感海域受到污染[3].此外,HFO 密度較高(0.92~1.02g/cm3 ),在碎波帶與泥沙混合后,更易于沉降.沉降后,在波浪和潮汐的作用下 HFO 可以在水體和砂礫海灘之間循環,源源不斷地釋放多環芳烴(PAHs)對水生生物產生毒害作用,這個過程就是孔隙水毒性假說[4].
已有學者在實驗室條件下利用裝填粘油礫石的容器模擬近岸處海底 HFO,發現魚類胚胎的畸形率和死亡率與流經粘油礫石的水體中 PAHs 濃度相關[5-9]. 事實上,海洋底棲生物,由于棲息在海底,不僅會暴露在有毒孔隙水中,還可能與海底 HFO 直接接觸,加之其活動能力低下難以逃出污染區,勢必會受到海底 HFO 的脅迫,因此海底 HFO 對海洋底棲生物的毒性影響亟待研究.
海膽主要棲息于淺海的巖礁、礫石、砂石等海底,對淺海生物群落的組成、結構和多樣性起著關鍵的作用[10-13].海膽生活史包括浮游幼體和底棲成體兩個主要階段.不僅早期浮游幼體對污染敏感性高 [14-21],其成年階段也被視作海洋生態毒理學研究和環境監測的有效生物模型[22-26].成年動物的繁殖能力對整個物種的延續起著至關重要的作用,海底 HFO 對成年海膽的毒害作用勢必會影響到其體內配子的生成、排放、受精過程,進一步影響子代發育, 從而對整個種群的生存產生影響[27-34].
本文以裝填粘油礫石的容器模擬海底 HFO,選擇海洋底棲模式生物海膽為受試生物,研究海底 HFO 對親代成年海膽繁殖能力、配子質量及其子代胚胎早期發育的影響.以期為評估溢油對海膽種群數量的影響提供參考數據,同時為海洋生態風險評估、自然資源損害評估以及船舶溢油索賠提供重要科學依據.
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗油品 HFO380,運動黏度 729800mPa·s (50℃),密度 0.9821g/cm3,由大連海洋燃油有限公司提供. 1.1.2 實驗礫石 直徑為 10~50mm 的表面平整的礫石,取自大連銀沙灘,洗凈烘干后備用.
1.1.3 實驗海水 取自大連市星海灣,鹽度(34±1) PSU,pH=(8.0±0.03).
1.1.4 實驗海膽馴化 繁殖期成年海膽購自大連海寶漁業有限公司.每只海膽注射 0.5mL 的 KCl,排黃色配子的為雌海膽,排白色配子的為雄海膽.將成功排配子的海膽在實驗室海水循環系統(大連匯鋅鈦設備)中馴化 2 周,海水溫度為(18±1)°C,光照周期為 12h:12h.期間每 3d 投喂海膽體重 5%的新鮮海帶.暴露實驗開始前 3d 停止喂食.馴化期間未出現自發排配子和死亡個體.
1.2 方法
1.2.1 粘油礫石制備[5,7,9] 將一定量的 HFO380 與 1.8kg 潔凈礫石放入混合容器中劇烈晃動 2min,使油盡可能的均勻的覆蓋在礫石表面.為避免相互干擾, 按粘油量由低至高依次制備不同濃度的粘油礫石. 然后將粘油礫石置于避光通風處 24h,用于暴露實驗. 實驗設置粘油礫石濃度為 0,400,800,1600,3200 和 6400μg 油/g 礫石(下文簡寫為 μg/g).0μg/g 為對照組.Zhadan 和 Vaschenko 的研究[33]表明暴露于被柴油污染的海水中 ( 總石油烴 (TPH) 濃 度 約 為 300μg/L)50d 的雌海膽所產子代的畸形率增加;在此基礎上,通過預實驗本文選擇 400μg/g 濃度組為最低濃度組,該組暴露液中 TPH 濃度從 618.5μg/L 降至 308.6μg/L.進一步預實驗發現,暴露于 16000μg/g 濃度組的雌海膽 2d 后出現自發排卵現象.暴露于 8000 和 4000μg/g 濃度組的雌海膽,在 7d 暴露期內未出現自發排卵現象,但是 8000μg/g 濃度組的雌海膽排卵數 目 少 . 不 足 以用于后 續子代 的暴露實驗 , 而 4000μg/g 組的雌海膽產卵數量足以用于后續實驗. 因 此 本文最 高濃度組的粘油量 應 介 于 4000~ 8000μg/g 之間.因此本文選擇 400,800,1600,3200 和 6400 μg/g,以此保證可以觀察到親代效應,并保證有足夠的卵細胞用于后續暴露實驗.
1.2.2 動態暴露裝置 裝置為上下加蓋的聚氯乙烯(PVC)柱(d=10.8cm,H=35cm),距底部 3cm 處有一進水管(d=1.2cm),出水管(d=1.2cm)位于對面距頂部 3cm 處,底部配備一個由 PVC 支柱(H=3.5cm)支撐的 PVC 網孔圓板放置礫石(圖1).進水流速以針閥控制. 粘油礫石制備完成后,轉移至該裝置,海水流速 20mL/min 由下至上流經粘油礫石柱,24h 后盛接流出液進行暴露實驗.
1.2.3 親代海膽暴露方法每個濃度組設置 3 個重復,每個重復包括 6 只雌海膽和 6 只雄海膽,雌雄海膽分開暴露(圖 1).暴露容器上部開孔,保證暴露溶液體積為 6L.暴露時間為 7d,暴露期間不充氣不喂食, 并虹吸出容器底部排泄物.
1.2.4 子代胚胎獲取及暴露方法 親代海膽暴露結束后,用 0.45μm 濾膜過濾海水(FSW)清洗體表,然后經圍口膜向海膽體腔內注射 1mL 現配的 KCl 溶液(0.5M).雌海膽口面向上置于盛滿 FSW 錐形瓶口處,雄海膽口面向上,擦干體表后置于干燥的培養皿上.30min后將雌海膽取下,將每重復組6只雌海膽所產卵細胞混合,置于18℃的FSW中暫放待受精.每重復組的 6 只雄海膽所排精子混合后置于 4℃待受精. 取 10μL 干精子稀釋于 5mL 的 FSW 中,加入到 500mL密度為100個/mL的卵細胞溶液中,輕輕晃動進行受精[35].胚胎親本組合有4種(如圖2所示):對照組(對照組卵細胞和對照組精子受精),母本暴露組 (暴露組卵細胞和對照組精子受精),父本暴露組(對照組卵細胞和暴露組精子受精)和雙本暴露組(暴露組卵細胞和同組精子受精).受精 15min 后,虹吸法洗卵 3 次以去除多余的精子.
來自于暴露親本的胚胎暴露濃度與其親代暴露濃度相同.對照組胚胎均分為 6 份,分別于 FSW 和粘油礫石柱流出液中培養.因此對于子代暴露實驗, 共有 5 個暴露濃度,每個濃度組包括 4 種親本組合的胚胎.胚胎于黑暗處(18±1)℃的水浴中培養,期間無需換水和喂食.
1.2.5 親代海膽相關參數測定 排配子率指排配子的雌或雄海膽個數與對應性別的海膽總數的比值.繁殖力指雌海膽開始排卵的 30min 內排出的卵的個數[36],其中將未排卵的雌海膽繁殖力記為 0.卵細胞計數使用 0.1mL 的浮游生物計數框進行,每只海膽重復計數 4 次并取平均值作為一只海膽的繁殖力.
1.2.6 配子質量 將每重復組 6 只雌海膽的卵細胞混合,取 3 個 1mL 重復樣品,滴入幾滴 40%福爾馬林,置于 4℃待測.顯微鏡(OLYMPUS IX73)觀測并拍照,使用 Cell Standard 軟件測量卵細胞直徑,每個樣品至少測量 100 個卵細胞.于受精 15min 后取 3 個 1mL重復樣品,加入幾滴40%福爾馬林置于4℃待觀察受精率.以受精膜鼓起為受精成功標志,每個樣品至少觀察 100 個受精卵.
1.2.7 子代海膽胚胎早期發育觀察 分別于受精后 24h(原腸胚期)和 48h(長腕幼蟲期)取樣,每重復組各取 4 個 2mL 重復樣品并滴入 40%福爾馬林放于 4 ℃, 在24h 內完成觀察,并記錄畸形率.正常發育的胚胎形態應滿足 4 個條件[37-38]:(1)胚胎在受精后 24h 進入原腸胚時期,受精后 48h 進入長腕幼蟲期;(2)胚胎呈現左、右和背、腹側對稱;(3)原腸期具備發育良好的原腸,長腕幼蟲期具備結構完整的消化道(口、胃、腸);(4) 長腕幼蟲期具備發育良好的骨針和腕.
1.2.8 綜合毒性指數(ITI)[35] 根據發育是否延遲和形態是否畸形,每個胚胎賦予從 0~10 不同分值.24h 正常晚期原腸胚為 0 分,原腸胚、囊胚和桑椹胚各得 1,3 和 4 分;當胚胎出現畸形形態時,原腸胚、囊胚和桑椹胚各得 5,7 和 10 分.48h 正常長腕幼蟲為 0 分,早期長腕幼蟲、棱柱幼蟲、原腸胚、囊胚和桑椹胚各得 2,3,4,5 和 5.5 分;當胚胎出現畸形形態時, 長腕幼蟲、早期長腕幼蟲、棱柱幼蟲、原腸胚、囊胚和桑椹胚各得 6,7,7.5,8,9 和 10 分.ITI 根據以下公式計算:
10 ITI ( )/100 n i i i S F = = ? ∑ (1)
式中:Si 為每類畸形胚胎得分;Fi 為這類胚胎出現的頻率(i=10).
1.2.9 暴露溶液組分分析方法 暴露期間每隔 24h 取水樣分析暴露液 TPH 濃度和 PAHs 濃度. TPH 采用紫外法測定(BIOTEK EPOCH2)[39].各濃度組各取 3 個混合流出液重復樣品,正己烷萃取,并于 225nm 下正己烷調零測定吸光度.根據以下標準曲線公式計算 TPH 濃度:
y = 0.051x-0.0033 (2)
式中:y 為樣品萃取液吸光度與正己烷吸光度差值;x 為萃取液 TPH 濃度,mg/L;R2 =0.9996.
PAHs 濃度采用氣相色譜/質譜聯用法(GC/MS) 測定.樣品前處理步驟參照 GB/T 21247-2007《海面溢油鑒別系統規范》[40].儀器型號 GC(HP 6890GC)- MS(5975),選擇SIM模式,內標法進行定量分析.色譜柱 為 DB-5MSUI, 長 30m, 內 徑 0.32mm, 膜 厚 度 0.25μm.載氣為高純氮氣,流量 1mL/min.升溫程序:50℃保持 2min,以 8℃/min 的速度升溫至 150℃, 保持 3min;再以 3℃/min 速度升溫至 300℃,保持 15min.分析 16 種 PAHs:萘,苊烯,苊,芴,菲,蒽,熒蒽,芘, 苯并[a]蒽,苯并[b]熒蒽,苯并[k]熒蒽,苯并[a]芘,茚并 [1,2,3-cd]芘,二苯并[a,h]蒽,苯并[ghi]芘.
1.2.10 數據統計分析 所有生物測定結果均以 3 個重復組測定值的(平均值±標準差)表示.采用 SPSS 19.0 軟件進行數據的正態性檢驗(Shapiro–Wilk 法) 和方差同質性檢驗(Levene 法).若數據滿足以上條件則進行方差分析,事后檢驗方法采用 Tukey HSD, 若方差不齊則事后檢驗采用 Dunnett 法.若數據不滿足以上 2 個條件,則采用非參數檢驗的 Kruskal Wallis 法和 Mann Whitney 法進行顯著性差異分析. 不同發育時期之間的差異采用配對 T 檢驗法. P<0.05 表示差異顯著.TPH 濃度為 3 個重復樣品的 (平均值±標準差),使用 OriginPro 軟件對 TPH 濃度和 PAHs 濃度進行擬合.
2 結果與討論
2.1 暴露溶液組分分析
2.1.1 TPH 濃度隨時間和礫石粘油量的變化 粘油礫石柱是一種模擬近岸處沉降溢油的動態系統 [41].結果表明隨著海水流經粘油礫石柱,所有濃度組的流出液中的 TPH 濃度呈指數形式降低,并具有良好相關性(R2 >0.95)(見表 1).這與溢油事故發生后實際測得的近岸處海水 TPH 濃度變化趨勢一致[42]. 此外,根據擬合公式可對毒性進行定量表征,克服了動態暴露系統中暴露溶液濃度難以預測的缺點.
分析不同粘油量礫石柱在經海水沖洗相同時間后流出液中 TPH 濃度變化,發現 TPH 濃度與礫石粘油量呈正相關(R2 >0.84)(見表 2).
2.1.2 PAHs 隨時間的變化及其與 TPH 的關系 親代海膽暴露期間溶液中 PAHs 濃度逐漸減小,并且各種組分之間的相對含量也有所變化.例如,6400μg/g 組暴露溶液中的 PAHs 含量在親代暴露期間由最初的 13.140μg/L 降低到結束時的 3.530μg/L.開始暴露時,暴露溶液中最主要的 PAHs 為萘(84.4%),其次為菲(7.3%).萘的分子量相對低且易揮發,暴露結束時萘的含量僅占了 38.2%,菲的相對含量增加到了 27.5%[7].6400μg/g 組粘油礫石上的 PAHs 濃度由 9.806μg/g 降低到了 6.408μg/g,各組分的相對含量也發生改變,萘相對含量由28.4%降低到15.8%,而菲的相對含量由 23.1%升高到 28.2%.
通過分析 6400μg/g 組暴露溶液中 PAHs 濃度及其對應的 TPH 濃度在 7d 內的變化趨勢,發現盡管 PAHs 的各種組分相對含量有所不同,但是 PAHs 濃度和 TPH 濃度在暴露期間呈現良好相關性(R2 = 0.866).考慮到 TPH 濃度與礫石粘油量呈良好相關性,因此本文中毒性均以礫石粘油量進行對比分析.
2.2 對親代海膽生長繁殖的影響
暴露在粘油礫石柱流出液中 7d 后,海膽排配子率顯著降低(Kruskal-Wallis,P=0.033).粘油礫石對海膽排配子率的影響無性別差異性(Mann Whitney, P>0.05).另外,與對照組相比((5551667±714587)個卵細胞),6400μg/g 組雌海膽排卵數量減少((1957917± 811471)個卵細胞),繁殖力顯著降低(1-way ANOVA, P=0.036),表明粘油礫石流出液 7d 暴露影響了海膽的繁殖狀態.這可能與壓力環境下海膽性腺內性細胞再吸收作用相關,性細胞的再吸收可以使海膽將更多的能量分配到細胞解毒和保護過程中.
2.3 對配子質量的影響
暴露組卵細胞的大小與對照組相比無顯著性差異(1-way ANOVA,P>0.05).結果表明,粘油礫石暴露對卵細胞的尺寸無顯著效應,說明卵細胞的大小不適合作為監測短期粘油礫石暴露對成年海膽繁殖狀態影響的指標.已有研究發現海膽種群密度大的區域雌海膽所排卵細胞較小,而種群密度小的區域雌海膽所排卵細胞較大,說明卵細胞的大小具有可塑性[43].Sch?fer 等[44]的研究發現菲的濃度為500μg/L暴露20d,抑制海膽性腺內未成熟卵細胞的生長.據此推斷本研究中卵細胞尺寸未發生變化可能是因為暴露時間較短,雌海膽未能及時調整卵細胞大小.
親代海膽暴露在粘油礫石柱流出液中 7d 對受精率并無顯著影響(2-way ANOVA,P>0.05),最大受精率為 800μg/g 組的雙本暴露受精卵((99.23± 0.69)%).結果表明,雄海膽短期暴露于粘油礫石流出液中并未影響精子的受精能力,與其他學者的研究結果一致[28,46].
2.4 對子代海膽胚胎早期發育的影響
將各組子代繼續暴露在相同濃度的流出液中培養 48h,并在胚胎受精后 24h 原腸期(圖 3)和 48h 長腕幼蟲期(圖 4)觀測子代畸形率,并計算綜合毒性指數(ITI,表 3).生長在 FSW 中的對照組雙親子代畸形率始終低于 10%.
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