發(fā)布時間：2021-10-16所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： [摘要]輔助生殖技術(shù)(ART)領(lǐng)域進(jìn)展迅速，由于臨床實(shí)踐中操作步驟繁瑣，如分選精子，卵母細(xì)胞的選擇，體外受精，胚胎培養(yǎng)，胚胎的監(jiān)測等，所以在效率和臨床決策方面仍有進(jìn)一步改進(jìn)的需求。微流控技術(shù)既是技術(shù)手段也是一門科學(xué)，它是在亞微升水平研究流體的行為
[摘要]輔助生殖技術(shù)(ART)領(lǐng)域進(jìn)展迅速，由于臨床實(shí)踐中操作步驟繁瑣，如分選精子，卵母細(xì)胞的選擇，體外受精，胚胎培養(yǎng)，胚胎的監(jiān)測等，所以在效率和臨床決策方面仍有進(jìn)一步改進(jìn)的需求。微流控技術(shù)既是技術(shù)手段也是一門科學(xué)，它是在亞微升水平研究流體的行為特征。其檢測系統(tǒng)管道及檢測終端具有極大靈活性，可適用于不同的檢測目的，其檢測精度高的同時節(jié)省樣本量，具有高度集成性特征，與輔助生殖實(shí)踐中的檢測需求相匹配。應(yīng)用微流控技術(shù)可以評估精子，卵母細(xì)胞和植入前胚胎結(jié)構(gòu)功能和環(huán)境等基本生物學(xué)信息，并據(jù)此給予準(zhǔn)確有效的應(yīng)對方案和臨床決策。基于上述內(nèi)容，本文中我們就微流控技術(shù)在輔助生殖上的應(yīng)用作一綜述，以期推進(jìn)微流控技術(shù)在生殖領(lǐng)域的應(yīng)用和完善。
[關(guān)鍵詞]輔助生殖技術(shù);卵母細(xì)胞;胚胎;分選;微流控
微流控(microfluidics)是指通過數(shù)十到數(shù)百微米微管道精確操控微尺度流體的一門科學(xué)和技術(shù)，是一門涉及物理、化學(xué)、微電子、材料和生物醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域的交叉新興學(xué)科[1]。微流控將常規(guī)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本功能縮小到幾平方厘米芯片之上，具有微型化、集成化特征。其最大優(yōu)勢是多種單元技術(shù)在整體可控的微小平臺上靈活組合、規(guī)模集成，使用非常少的樣本和試劑做出高精度和高敏感度的分離和檢測，費(fèi)用低，分析用時短[2]，見圖1。微流控技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、化學(xué)、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等領(lǐng)域，并開始在實(shí)驗(yàn)室檢測和臨床治療等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中嶄露頭角。人類輔助生殖技術(shù)(assistedreproductivetechnology，ART)雖然取得了長足的發(fā)展，但是其效率仍然較低，因此，人們在不斷尋求新的技術(shù)手段以改善結(jié)果和提高效率。此外，輔助生殖技術(shù)由于脫離了自然選擇和體內(nèi)生殖道環(huán)境，影響植入前胚胎的質(zhì)量和懷孕率，可能通過表觀遺傳機(jī)制影響下一代的健康。因此，尋求新技術(shù)對輔助生殖流程進(jìn)行優(yōu)化更加迫切[3]。基于微流控技術(shù)自身優(yōu)勢將其應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域，將對推動輔助生殖技術(shù)發(fā)展起到重大的作用，并有可能徹底改變輔助生殖過程[4]。目前，微流控技術(shù)在ART中的應(yīng)用和研究主要集中在胚胎培養(yǎng)上，隨著微流控技術(shù)自身的發(fā)展和完善，也逐步應(yīng)用于輔助生殖實(shí)驗(yàn)室配子和胚胎操作的各個環(huán)節(jié)。在本綜述中，我們將總結(jié)近年來微流控技術(shù)在配子篩選，卵母細(xì)胞成熟和胚胎培養(yǎng)等生殖領(lǐng)域中的應(yīng)用，并對其發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。
1.微流控技術(shù)與雄性生殖細(xì)胞
1.1微流控精液分析:目前，男科臨床上通過1個或多個參數(shù)來評估精子質(zhì)量，這些參數(shù)包括精液的液化時間，pH值、精子濃度、活力、形態(tài)和DNA完整性，以及精漿果糖等[5]。這些分析技術(shù)難度大，勞動強(qiáng)度高，主觀影響大，人員需要專門培訓(xùn)。此外，即使是先進(jìn)的計算機(jī)輔助系統(tǒng)(例如ComputeraidedSemenAnalysisSystem，CASA)也需要手動稀釋和混勻。操作簡便，檢測迅速，分析準(zhǔn)確的精液分析技術(shù)的開發(fā)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。這些改變發(fā)生在2010年，Segerink等[6]研發(fā)出了一種芯片，它可以計算男性精子濃度，并衡量其流動性，該技術(shù)采用電極片進(jìn)行電流的感應(yīng)，在精子細(xì)胞通過時，電阻發(fā)生短暫變動可以測出精子濃度，同時，基于電阻抗的差異可以將精子、白細(xì)胞和其他細(xì)胞區(qū)分開。2017年Schaff等[7]基于微流控平臺開發(fā)出一種小型的離心裝置，這種便攜式的男性生育能力檢測儀可以讓男性在家自行進(jìn)行精液質(zhì)量定期監(jiān)測。隨后Kanakasabapathy等[8]將智能手機(jī)與微流控檢測平臺相結(jié)合最終直接將檢測結(jié)果發(fā)送到智能手機(jī)，通過與實(shí)驗(yàn)室的精液分析儀進(jìn)行比較，其準(zhǔn)確性為98%，從而成為家庭的即時診斷工具。最近，Zhou等[9]總結(jié)了近些年微流控技術(shù)在精液檢測方面的相關(guān)研究進(jìn)展。
1.2微流控精子分選:在體外受精(invitrofertilization，IVF)中，通常要根據(jù)精液特征(如精液量、精子濃度及精子活力等)采用適當(dāng)?shù)姆绞綄⒕臃蛛x，從而進(jìn)行體外受精或者卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmicsperminjection，ICSI)和供精者精液授精(artificialinseminationwithdonor’ssemen，AID)。傳統(tǒng)的處理方法一般是將精液簡單地培養(yǎng)洗滌，分離出精子進(jìn)行后續(xù)操作。這種方法耗時、耗力，并且會帶來精子損傷，例如，離心過程中精子DNA的斷裂。實(shí)際上，微流控芯片在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最初也是用于精液檢測。Kricka等[10]在20世紀(jì)90年代用鈉鈣玻璃和硅做材料制造的微管道設(shè)備，通過計算精子游動10mm所用的時間來測算精子數(shù)量和活力。在2003年Cho[11]和Schuster[12]等通過基于微流體和含有黏彈性介質(zhì)的微通道對精子進(jìn)行分離，這是因?yàn)榛盍^好的精子具有較高的擴(kuò)散率，跨越層流線從而實(shí)現(xiàn)無離心的精子分離。這種方法不僅有效地減少了離心過程中損傷精子DNA產(chǎn)生的負(fù)面影響，同時大大提高了分離效率。基本實(shí)現(xiàn)了簡單、快速、低損傷的精子處理原則，但是該方法由于制作工藝和微流體流速的限制還不能大量應(yīng)用于臨床。在2014年Nosrati等[13]提出了一種臨床上可應(yīng)用的微流體裝置，該裝置基于500個平行微通道中的進(jìn)行性運(yùn)動來選擇精子。20min內(nèi)可以從1ml精液中純化出精子活力良好且DNA完整的精子。公牛精子的實(shí)驗(yàn)表明，所選精子活力提高了89%以上，人類精子臨床測試顯示，人類DNA完整性提高了80%以上。Knowlton等[14]通過綜述總結(jié)了近幾十年微流控技術(shù)在精子的形態(tài)、活力、DNA完整性等方面對精子進(jìn)行篩選檢測，以及其在人類和動物研究上的進(jìn)展。微流控技術(shù)自身的完善以及聯(lián)合其他分析技術(shù)將會在精子分選的檢測中發(fā)揮更高的效能。
2.微流控技術(shù)與雌性生殖細(xì)胞
2.1微流控卵母細(xì)胞分選:正常成年男性每天都可以產(chǎn)生大量的精子，然而卵子的數(shù)量從一出生就已經(jīng)決定。臨床上，通過激素促排卵，在較好的情況下每次可以獲取10枚左右的卵子，加之每個周期都很長，患者壓力也很大，因此，選擇好的卵子和選擇好的精子對于ART的成功同等重要。臨床上對于卵子的選擇通常是由專業(yè)胚胎操作師根據(jù)卵子成熟后的形態(tài)進(jìn)行主觀判斷，既高度依賴人工，又忽略了卵子的發(fā)育過程，因此，很難對卵子質(zhì)量進(jìn)行全面評估。而現(xiàn)有的實(shí)時成像監(jiān)測裝置造價昂貴，基于微流控平臺可以對卵子篩選實(shí)現(xiàn)定量分析。Angione等[15]設(shè)計了一種微流控平臺，可以及時觀察和有效記錄單個卵母細(xì)胞的發(fā)育情況和形態(tài)，這種微流控裝置通過記錄卵子的發(fā)育情況，即應(yīng)用卵細(xì)胞膜的特性可對每個卵子進(jìn)行仔細(xì)分析，精確地判斷。Hwang等[16]開發(fā)了一種在電場條件下質(zhì)量不同卵子移動速度不同的自動化分析平臺，客觀高效地對卵子的質(zhì)量進(jìn)行了分選和評估。Murayama等[17]設(shè)計了一種微機(jī)械感應(yīng)器，通過感應(yīng)卵子表面彈性用于卵子質(zhì)量評估。此外，可以通過基因組學(xué)、分子生物等方法檢測卵丘細(xì)胞中基因和蛋白的表達(dá)對卵子的狀態(tài)進(jìn)行評估和分析[18，19]。
2.2卵母細(xì)胞體外成熟:卵母細(xì)胞體外成熟是輔助生殖的基本技術(shù)之一，通常針對一些卵子成熟障礙的不孕患者，例如，多囊卵巢綜合征、卵泡發(fā)育遲緩的患者[20]。與傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方法相比較，增加微流體更利于卵母細(xì)胞的成熟。此外，通過輔助未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)可以避免卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生。但是，由于未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)的有限性，體外成熟的卵子質(zhì)量相對體內(nèi)較低，所幸的是微流控技術(shù)能夠提高體外成熟卵子的質(zhì)量。2001年Walters等[21]首先通過微流控裝置實(shí)現(xiàn)了對豬卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)，與傳統(tǒng)的微滴法培養(yǎng)相比，微流控裝置顯著提高了豬卵母細(xì)胞的MII期卵子的成熟率。更具意義的是，微流控通道中卵母細(xì)胞卵丘細(xì)胞擴(kuò)散減少了，即微流控通道能夠改善豬卵母細(xì)胞的核成熟，但可能限制胞質(zhì)成熟，這可能是因?yàn)槲⒘黧w通道的物理空間大小限制了卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散。隨后，Hester等[22]證實(shí)微流控培養(yǎng)的成熟卵子其受精能力也顯著高于傳統(tǒng)的微滴法。傳統(tǒng)的卵母細(xì)胞成熟技術(shù)在卵子成熟以后需要通過機(jī)械法或者酶消化法去除卵丘細(xì)胞，操作過程比較繁瑣，耗費(fèi)時間，同時，這種操作可能會對胚胎的后續(xù)發(fā)育造成影響。目前，由微流控裝置已經(jīng)可以通過機(jī)械法和酶消化法實(shí)現(xiàn)對卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的卵子的剝離。此外，微流控芯片可以連續(xù)實(shí)現(xiàn)對小鼠成熟卵子的卵丘細(xì)胞的自動化剝離，這種芯片大大簡化了卵母細(xì)胞體外成熟的操作流程[23]。
3.微流控技術(shù)與體外授精
體外授精是ART中很重要的技術(shù)，將微流控平臺用于體外受精最大的優(yōu)勢是可以實(shí)時觀察，并且控制體外受精精子量。因?yàn)槌Ｒ?guī)條件下過多的精子受精會導(dǎo)致多核胚胎的發(fā)生，導(dǎo)致胚胎染色體混亂，而精子數(shù)量過少則可能降低受精率。精子的活力，卵母細(xì)胞的質(zhì)量以及流體運(yùn)動都會影響微流控平臺的受精結(jié)果。在體外受精中，如果精子濃度低，則將決定由ICSI進(jìn)行授精，從而克服了精子濃度低導(dǎo)致受精率下降的問題。然而，由于使用ICSI技術(shù)具有機(jī)械侵入性，存在潛在的安全性問題，且該技術(shù)需要經(jīng)驗(yàn)豐富的ICSI技術(shù)人員操作[24]。而微流控平臺可以解決這一問題，是臨床ICSI的潛在替代方法。例如，Suh等[25]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)精子濃度低至2×107/L，與標(biāo)準(zhǔn)孔培養(yǎng)皿相比，在微流體平臺上的受精率明顯更高，而傳統(tǒng)的體外受精方式精液的濃度需要達(dá)到(0.5～1.0)×109/L。此外，將微流體IVF平臺和卵母細(xì)胞分選平臺相結(jié)合選擇高質(zhì)量精子和健康的卵母細(xì)胞進(jìn)行受精，則可大大提高IVF受精質(zhì)量。國內(nèi)的Han等[26]報告了一種新型微孔結(jié)構(gòu)的微流控裝置，該裝置集合單個卵母細(xì)胞的分選，受精和胚胎培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了在微流體裝置與傳統(tǒng)方式一樣的受精率，優(yōu)勢是此微流體裝置可通過簡化卵母細(xì)胞的處理和操作流程，實(shí)現(xiàn)了快速方便地更換培養(yǎng)基以及對單個卵子持續(xù)監(jiān)測和分選。這些研究都顯示了微流控芯片在體外受精研究中的優(yōu)越性和潛在的應(yīng)用前景。
4.微流控技術(shù)與胚胎
4.1胚胎分選:選擇好的胚胎進(jìn)行移植對于臨床上能否正常妊娠顯得極為重要，甄別胚胎好壞最常用的方法是通過顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)評分。臨床上一般通過顯微鏡觀察卵裂率，胚胎細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞破碎程度，囊胚形態(tài)等。然而，顯微鏡觀察可能是主觀的，缺乏預(yù)測價值，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部和各個實(shí)驗(yàn)室之間都有差異，且無法對胚胎的整個培養(yǎng)過程進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測。此外，反復(fù)的胚胎觀察會影響后續(xù)胚胎發(fā)育。微流控裝置為能夠進(jìn)行生化非侵入性分析和選擇胚胎提供了一條新的途徑。目前已經(jīng)積累了大量用于胚胎生物標(biāo)志物測量的數(shù)據(jù)，例如，氧代謝，氨基酸代謝和能量代謝等。O’Donovan等[27]開發(fā)并測試了一種呼吸微流控裝置，可以監(jiān)測2細(xì)胞小鼠胚胎的耗氧量，通過在1h時間內(nèi)監(jiān)視多達(dá)10個植入前胚胎，該生物芯片監(jiān)測2細(xì)胞胚胎和植入前胚胎細(xì)胞的耗氧量，為胚胎的篩選和評估提供了一種非侵入性、簡單且方便的方法。Urbanski等[28]通過設(shè)計微流控芯片，巧妙地通過微熒光酶分析法評估與胚胎發(fā)育相關(guān)的葡萄糖、丙酮酸和乳酸的消耗和產(chǎn)生情況，通過標(biāo)準(zhǔn)化自動化程序，檢測了整個培養(yǎng)期間單個胚胎和單個細(xì)胞進(jìn)行代謝的情況。Heo等[29]在單個集成設(shè)備上，設(shè)計了能夠胚胎培養(yǎng)和對代謝產(chǎn)物進(jìn)行自動分析的微流控芯片。盡管這些微流體胚胎測定法目前已用于小鼠胚胎，但尚未應(yīng)用于人類胚胎，且微流控的設(shè)計和測定仍需要進(jìn)一步完善。但是可以想象，基于微流控將胚胎培養(yǎng)和非侵入性的生物標(biāo)志相結(jié)合用于胚胎篩選，將極大地提高移植胚胎質(zhì)量和分選效率。
4.2胚胎培養(yǎng):胚胎體外發(fā)育率很低的原因之一就是胚胎培養(yǎng)程序太多太復(fù)雜，期間各種胚胎操作的變化都會影響胚胎發(fā)育。近些年已經(jīng)在精簡胚胎操作程序以提高胚胎發(fā)育質(zhì)量，但是由于體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)差異很大，胚胎發(fā)育質(zhì)量仍然較差。微流控芯片微尺度的環(huán)境能夠模擬正常生理狀況的特點(diǎn)，決定了它用于胚胎培養(yǎng)的優(yōu)勢。Glasgow等[30]將小鼠受精卵在微管道中成功培養(yǎng)到2-細(xì)胞期。Wheeler等[31]通過微流控芯片對豬的4-細(xì)胞期胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)得到囊胚，隨后進(jìn)行體外移植得到5只仔豬。Raty等[32]的研究指出，小鼠早期胚胎在微流控裝置中培養(yǎng)后囊胚率顯著高于微滴組。國內(nèi)的王維等[33]模擬人體環(huán)境構(gòu)建微流控芯片，通過對小鼠受精卵持續(xù)的灌注培養(yǎng)，結(jié)果證實(shí)，微流控動態(tài)法對4-細(xì)胞胚胎、桑椹胚和囊胚形成率均有顯著提高。目前，通過微流控裝置對胚胎培養(yǎng)的研究主要集中在動物上，但最近有報道，通過微流控裝置對人類的冷凍胚胎進(jìn)行了體外培養(yǎng)，但是結(jié)果并沒有證實(shí)微流控能夠提高后續(xù)胚胎發(fā)育質(zhì)量[34]。由此看來，微流控平臺能否提高人類胚胎發(fā)育質(zhì)量需要更多地研究和實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
4.3胚胎冷凍保存:哺乳動物卵母細(xì)胞和胚胎冷凍技術(shù)在過去幾十年間取得了巨大的進(jìn)步，然而，相比新鮮卵母細(xì)胞和胚胎，冷凍保存胚胎的發(fā)育成功率依舊很低[35]。目前胚胎冷凍保存技術(shù)廣泛應(yīng)用于慢性疾病，癌癥治療或者由于其他疾病將喪失生育能力的婦女[36，37]。胚胎冷凍保存分為兩種，慢速冷凍和玻璃化冷凍，目前，玻璃化冷凍技術(shù)以其高達(dá)90%的成功率應(yīng)用最為廣泛，玻璃化冷凍面臨的挑戰(zhàn)主要來源于冷凍保護(hù)劑的滲透損傷、毒性損傷和冷凍過程中冰晶的形成。2011年Heo等[38]首先將微流控裝置用于胚胎的冷凍保存。2015年Lai等[39]建立了一種自動化的微流控冷凍平臺對大鼠的卵子和受精卵進(jìn)行冷凍，結(jié)果顯示，自動化的微流控冷凍平臺顯著改善了冷凍后卵子和胚胎的形態(tài)，有效提高了胚胎發(fā)育質(zhì)量。Roy等[40]開發(fā)了一種微流控裝置，這種微流控裝置能夠及時檢測在加載不同的冷凍保護(hù)劑過程中單個小鼠卵母細(xì)胞的體積變化，這種微流控裝置將對未來新的冷凍保護(hù)劑開發(fā)和改進(jìn)原有的冷凍保存配方和程序起到極大的促進(jìn)作用，并有望應(yīng)用于人類輔助生殖中。國內(nèi)的楊云等[41]制作了用于豬卵母細(xì)胞冷凍的微流控裝置，提高了卵母細(xì)胞存活率及卵裂率。周新麗等[42]設(shè)計了用于添加-去除保護(hù)劑的微流控芯片，并首次與冷凍載體相結(jié)合，對豬卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存研究，也取得了不錯的效果。
5.微流控技術(shù)在生殖領(lǐng)域應(yīng)用的未來
在過去的20年中，經(jīng)過各行業(yè)人共同努力，使得微流控這一跨學(xué)科的技術(shù)在哺乳動物配子和胚胎的分離、分析和冷凍保存中取得了重大進(jìn)展。但微流控技術(shù)的應(yīng)用還局限在動物實(shí)驗(yàn)水平上，距離人類胚胎的廣泛應(yīng)用還有一段很長的路要走。同時，微流控芯片在輔助生殖上的應(yīng)用還需要改進(jìn)和優(yōu)化。因?yàn)槟壳拔⒘骺丶夹g(shù)在生殖領(lǐng)域的應(yīng)用主要考慮的是其功能的完善和自動化操作上，其過程還相對復(fù)雜，且尚未考慮到臨床應(yīng)用的便捷性和使用成本。此外，微流控技術(shù)在人類胚胎上的實(shí)驗(yàn)計劃空白，微流控技術(shù)到底能否改善ART結(jié)果還需要更多的動物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)和填補(bǔ)。不過隨著微流控芯片的進(jìn)一步研究和優(yōu)化，相信可以開發(fā)出更符合臨床應(yīng)用的微流控芯片。——論文作者：王中立1，2王琪3鄧娟4雷蘭杰4，5楊磊2，5*
相關(guān)期刊推薦：《解剖學(xué)報》創(chuàng)刊于1953年，是由中國解剖學(xué)會主辦，代表我國解剖學(xué)科發(fā)展水平的綜合性學(xué)術(shù)期刊。主要刊載細(xì)胞學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、組織胚胎學(xué)、干細(xì)胞和組織工程學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、大體解剖學(xué)和比較解剖學(xué)、人類學(xué)諸學(xué)科中創(chuàng)建性、前沿性的科研論著。
