金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留的UPLC-PDA分析

發布時間：2021-09-29所屬分類：工程師職稱論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要：研究建立了快速檢測金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留的UPLC-PDA分析方法.樣品用乙腈提

　　摘要：研究建立了快速檢測金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留的UPLC-PDA分析方法.樣品用乙腈提取、PSA-C18-MWCNTs-OH分散固相萃取凈化,經UPLC分離后于254nm波長下檢測.結果顯示,氯蟲苯甲酰胺質量濃度在0.05~5.00mg/L之間時,線性響應良好,曲線方程為y=6842.6x+27.745,R2=0.9991;平均回收率均在91%~104%之間,RSD小于6%;分析方法的LOD和LOQ分別為0.017μg/kg和0.028mg/kg.整體來看,UPLC-PDA殘留分析方法前處理程序簡單、高效、可靠、節省有機溶劑;該方法靈敏度、準確度和精密度等性能指標均可滿足農藥殘留分析要求,可作為金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留量檢測的推薦方法.

　　關鍵詞：金銀花;氯蟲苯甲酰胺;QuEChERS;羥基化碳納米管;UPLC-PDA

　　金銀花(LoniceraeJaponicaeFlos)是忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或初開的花[1],具有渲散風熱、清熱解毒和消炎退腫之功效[2],該中藥材具有悠久的歷史.近年來,隨著金銀花在治療病毒性急性呼吸道疾病(如SARS、H7N9、COVID-19等)方面的功效而倍受關注[3-4].

　　氯蟲苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)是美國杜邦公司于2000年成功開發的鄰甲酰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑,該殺蟲劑對危害多種農作物的重要鱗翅目害蟲防效優異[5].氯蟲苯甲酰胺是昆蟲魚尼丁受體(RYR)的高效激活劑,二者結合后,將導致RYR的鈣離子通道異常開放,使貯存在肌肉細胞內的鈣離子大量釋放,引起肌肉調節功能衰弱、麻痹,最終導致害蟲癱瘓死亡[6].氯蟲苯甲酰胺純品為白色晶體,熔點為208~210℃,分解溫度為330℃,蒸氣壓(20℃)為6.3×10-12Pa,logPo(wpH7.0,20℃)為2.86,pKa(20℃)為10.88,Henry常數(20℃)為3.2×10-9Pa·m3,在水、丙酮、甲醇、乙腈中的溶解度(20℃)分別為1.023、3.446、1.714和0.711mg/L[7].

　　近年來,隨著金銀花在醫療、保健方面需求的不斷增加,其種植面積逐年擴大[8],隨之而來的病蟲害問題開始凸顯,藥農不得不施用各種農藥,給金銀花產品品質帶來了嚴重的農藥殘留安全風險.當前,氯蟲苯甲酰胺在我國蔬菜、水果和糧食作物上獲準登記使用,在金銀花種植上尚未獲得應用登記,我國、歐盟和美國等均無金銀花中氯蟲苯甲酰胺的殘留限量標準.由于氯蟲苯甲酰胺在害蟲防控方面表現出的高效、廣譜和持效性,其在金銀花生產過程中的違規使用現象時有發生.

　　目前已報道的植物源樣品中氯蟲苯甲酰胺殘留分析方法主要包括液相色譜法(樣品基質涉及果蔬[9-11]、谷物[12-14]、中藥材[15]和環境樣品[16-17]等)、液質聯用法(樣品基質涉及果蔬[18-20]、谷物[21-22]、植物調味品[23]和中藥材[24]等)、氣相色譜法[25]、氣質聯用法[26-28]和毛細管電泳法[29-30]等.盡管基于單離子監測(SIM)或選擇反應監控(SRM)模式的質譜檢測技術可以大大簡化樣品前處理程序,但價格昂貴,而目前報道的氣相色譜或液相色譜檢測技術存在步驟繁瑣、費時、費力等缺點.

　　截至目前,尚無金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留分析方面的文獻報道.本研究擬在已報道相關分析方法基礎上,建立金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留的QuEChERS樣品前處理程序和UPLC-PDA分析方法,該研究對于保障以金銀花為原材料的藥材產品品質和健全氯蟲苯甲酰胺的殘留安全風險評估方面具有重要意義.

　　1材料與方法

　　1.1試驗藥品

　　氯蟲苯甲酰胺標準溶液(100mg/L,溶劑為乙腈),德國Dr.Ehrenstorfer公司;HPLC級的甲醇和乙腈,美國Mreda公司;氯化鈉、硫酸鎂和乙酸銨,國藥集團化學試劑有限公司;PSA、C18和GCB,天津博納艾杰爾科技有限公司;MWCNTs-COOH和MWCNTs-OH,北京德科島金科技有限公司;MWCNTs-COOH和MWCNTs-OH使用前均在120℃下烘干2h,硫酸鎂使用前130℃烘干6h.試驗用水由Millipore超純水系統制備.

　　1.2試驗儀器

　　UPLC-PDA系統,配置真空脫氣機、瓶式自動進器、二元泵、四元溶劑分配系統、柱溫箱和PDA檢測器;Empower3數據采集和處理系統,美國Waters公司;VORTEX3渦旋混合儀,德國IKA公司;TDL-5000B型低速冷凍大容量離心機,上海安亭科學儀器廠;GTR16-2型高速冷凍離心機,北京時代北利離心機有限公司;JJ500Y型電子天平,常熟市雙杰測試儀器廠;FW100型高速萬能粉碎機,蘇州江東精密儀器有限公司;Milli-Q超純水系統,美國Millipore公司.

　　1.3試驗材料

　　金銀花,河南省封丘縣金銀花種植基地.試驗所用金銀花樣品經干燥、粉碎后用塑封袋封裝,并于-20℃下保存,待測.

　　1.4試驗方法

　　1.4.1色譜分析條件色譜柱為WatersAcquityUPLCBEHC18柱(2.1×100mm,1.7μm);柱溫30℃;流動相乙腈和濃度為5mmoL/L乙酸銨水溶液(體積比V∶V=60∶40),流速為0.4mL/min;PDA的檢測波長范圍200~400nm,分析波長為254nm;進樣量為2μL.

　　1.4.2標準曲線繪制將氯蟲苯甲酰胺標準溶液用乙腈提取液稀釋為系列工作溶液,在優化的色譜條件下,分別對所配制的標準溶液進行色譜測定,以質量濃度為橫坐標、對應的色譜峰積分面積為縱坐標繪制標準曲線,求得線性回歸方程和相關系數;分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)測定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ).

　　1.4.3回收率試驗預先配制0.1、1.0和2.0mg/L質量濃度的氯蟲苯甲酰胺標準溶液,各取1mL分別添加至盛裝有2.0g均質化金銀花空白樣品的50mL離心管中,得到含量為0.05、0.50和1.00mg/kg三個添水平的標樣添加樣品,各添加水平均作3次重復,渦旋混勻后靜置30min,使添加的農藥標樣與樣品基質充分吸附;加入2mL去離子水和10mL乙腈,渦旋混勻2min,再加入2g氯化鈉,渦旋混勻1min,5000r/min離心5min,小心移取1mL上清液至2mL聚四氟乙烯具塞離心管(預先盛裝有25mgPSA、25mgC18、50mg硫酸鎂和25mgMWCNTs-OH),劇烈渦旋1min,12000r/min離心5min,上清液通過0.22μm針頭過濾器過濾;按照1.4.1的UPLC-PDA色譜條件進行樣品檢測,根據1.4.2中求得的標準曲線進行外標法定量校準,并根據分析結果計算添加回收率及各添加水平3個平行樣品測定值間的相對標準偏差(RSD).1.4.4實際樣品檢測實際樣品嚴格按照與1.4.3相同的方法制備,然后采用1.4.1方法進行樣品分析.

　　2結果與分析

　　2.1色譜分析條件

　　氯蟲苯甲酰胺標準樣品、金銀花空白樣品及氯蟲苯甲酰胺空白添加樣品色譜圖如圖2所示

　　在色譜方法優化過程中發現,以AcquityUPLCBEHC18柱(2.1×100mm,1.7μm)為分離分析柱,柱溫30℃,乙腈和濃度5mmoL/L乙酸銨水溶液(體積比V∶V=60:40)為流動相,流速為0.4mL/min,檢測波長254nm,進樣量2μL,可獲得金銀花樣品中氯蟲苯甲酰胺良好的分離效果.分離結果如圖1所示,色譜保留時間為1.05min,且峰形良好、金銀花樣品基質無干擾.

　　2.2線性方程及相關系數

　　分析方法的線性方程及相關系數如圖2所示.

　　由圖2可知,將溶解于乙腈的質量濃度為100mg/L氯蟲苯甲酰胺標準溶液用金銀花空白樣品提取液逐級稀釋為質量濃度分別為0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50和5.00mg/L的基質標樣,在最佳色譜條件下進樣測定,以質量濃度為橫坐標、以對應的色譜峰積分面積為縱坐標繪制標準曲線,擬合出線性回歸方程為y=6842.6x+27.745,相關系數為R2=0.999.

　　2.3準確度和精密度

　　通過加標回收率和相對標準偏差(RSD)來確定分析方法的準確度和精密度.圖1-c和圖1-d分別為金銀花空白樣品中氯蟲苯甲酰胺含量為0.5mg/kg的標樣添加色譜圖和相應的紫外吸收光譜檢測結果,表1為金銀花空白樣品中氯蟲苯甲酰胺含量分別在0.05、0.50和1.00mg/kg三個添加水平時的回收率試驗結果.由表1可知,金銀花空白樣品中氯蟲苯甲酰胺的平均回收率均在91%~104%,RSD均小于6%.通過在金銀花空白樣品提取液中添加少量適當質量濃度的氯蟲苯甲酰胺標準溶液進樣分析,并分別以S/N=3和S/N=10計算方法的LOD和LOQ為0.017μg/kg和0.028mg/kg.

　　2.4實際樣品分析

　　應用所開發殘留樣品前處理程序(1.4.3)和儀器分析方法(1.4.1)分別對源于8個藥材商家的8份金銀花樣品進行氯蟲苯甲酰胺殘留量檢測,結果顯示,3份金銀花樣品中含氯蟲苯甲酰胺殘留檢測量分別為0.060mg/kg、0.073mg/kg和0.130mg/kg,其余5份均為未檢出.

　　3結論與討論本

　　研究在色譜分析方法開發過程中分別嘗試用甲醇、乙腈及不同pH的甲醇和乙腈作為流動相,試驗可知,用體積比為60∶40的乙腈和濃度為5mmoL/L的乙酸銨水溶液作流動相時不但保證氯蟲苯甲酰胺有合適的色譜保留時間,而且峰形更加尖銳、對稱性更好.此外,為避免因色譜柱溫度變化造成重現性差,以及因流動相黏度高造成色譜柱柱壓偏高、柱效降低,最終設定色譜柱柱溫為30℃.

　　金銀花樣品中含有黃酮、有機酸、揮發油、環烯醚萜、甾醇和植物色素等[31],基質成分相對復雜,給金銀花殘留樣品分析帶來難度,本研究引入基質匹配標準曲線外標法進行定量校準.傳統的QuEChERS方法使用PSA和C18作為凈化材料,PSA表面為極性官能團,主要吸附樣品中較強極性的雜質,如有機酸、糖及部分色素等;C18材料為弱極性吸附劑,對弱極性物質有較強的吸附能力,可去除樣品中脂肪和蠟質等弱極性雜質,并對樣品中硫化物等雜質有較好的去除效果;GCB主要用于去除樣品提取物中的大部分可見植物色素和固醇類物質,對平面型有機分子有較強的吸附能力[32].CNTs為新型碳納米吸附材料,具有典型的層狀中空結構,具有較大的比表面積、較好的熱穩定性、機械穩定性及疏水性,CNTs與樣品基質間的疏水作用及π-π相互作用使其對樣品基質中的色素等極性成分有較好的吸附能力[33].本研究分別比較了25mgMWCNTs-COOH、MWCNTs-OH和GCB對1mL金銀花樣品乙腈提取液中植物色素和目標分析物的去除效果和吸附情況,發現三種吸附材料對樣品提取液中植物色素的凈化效果無明顯差別,它們對氯蟲苯甲酰胺的吸附量依次為GCB>MWCNTs-COOH>MWCNTs-OH,MWCNTs-COOH對氯蟲苯甲酰胺的吸附能力與其易于和氯蟲苯甲酰胺分子中的氨基形成酰胺鍵有關;而GCB對氯蟲苯甲酰胺較強的吸附能力應歸因于氯蟲苯甲酰胺近乎平面型的分子構型[34].

　　本研究建立的金銀花中氯蟲苯甲酰胺殘留改良版QuEChER樣品前處理程序,不僅有效降低了影響定量分析結果的樣品基質含量,而且與常規樣品前處理方法相比大幅度減少了有機溶劑的消耗量，并且有效提高了分析樣品制備效率.同時在UPLC-PDA分析過程中,采用基質匹配標準曲線定量校準的方法有效降低了樣品基質對殘留檢測結果的影響.本研究開發的殘留分析方法可以作為氯蟲苯甲酰胺在金銀花種植上應用登記殘留試驗的方法選項.——論文作者：王建華,徐莉,蔣鑫,王曉,張穎,李廣領

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