發(fā)布時(shí)間：2022-05-09所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要: 從馬齒莧植株中分離內(nèi)生真菌，提取其代謝產(chǎn)物，以黃酮類化合物顯色反應(yīng)和紫外光譜特征對(duì)內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定，篩選得到產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌 AG -10，使用 ITS1、ITS4 通用引物，擴(kuò)增菌株 AG-10 的 18S rDNA 序列，結(jié)合菌落和分生孢子形態(tài)特征，對(duì)菌株 AG-10
摘 要: 從馬齒莧植株中分離內(nèi)生真菌，提取其代謝產(chǎn)物，以黃酮類化合物顯色反應(yīng)和紫外光譜特征對(duì)內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定，篩選得到產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌 AG -10，使用 ITS1、ITS4 通用引物，擴(kuò)增菌株 AG-10 的 18S rDNA 序列，結(jié)合菌落和分生孢子形態(tài)特征，對(duì)菌株 AG-10 進(jìn)行分類鑒定，并采用濾紙片法研究 AG-10 的代謝產(chǎn)物抑菌效果; 菌株 AG-10 鑒定結(jié)果為鐮刀菌( Fusarium sp.) ，其代謝產(chǎn)物可抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，最小抑菌質(zhì)量濃度分別為 1. 0 mg /mL 和 2. 0 mg /mL。研究結(jié)果證實(shí)了馬齒莧中存在有可能產(chǎn)黃酮類化合物的內(nèi)生真菌，為利用微生物產(chǎn)黃酮類化合物提供參考。
關(guān)鍵詞: 馬齒莧; 內(nèi)生真菌; 黃酮; 抑菌
0 引 言
植物內(nèi)生菌( Endophyte) 是指能夠生活在植物各組織和器官內(nèi)，而不引起植物病變的一類微生物，可分為真菌、細(xì)菌和放線菌三大類[1]，自 1993 年 A. Stierle 等[2]人從紅豆杉中分離得到一株能夠產(chǎn)紫杉醇的 Taxomyces andreanae 的真菌后，為植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)天然活性物質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。植物的生長各階段、藥用成分都與內(nèi)生菌尤其是內(nèi)生真菌[3]相關(guān)，植物內(nèi)生真菌的主要代謝產(chǎn)物為糖類、苯丙素類、醌類、黃酮類、萜類、甾體和生物堿等類群[4]，其中黃酮類化合物因具有抗 炎、抗菌和抗病毒等作用而受到 普遍關(guān)注[5-6]。馬齒莧( Portulaca oleracea L.) 為常見草本植物，主要生物活性成分: 黃酮類、生物堿、多糖類、兒茶酚、三萜類，具有抗菌、抗氧化作用、抗病毒等作用[7-10]，目前主要集中在對(duì)馬齒莧代謝產(chǎn)物的研究，但對(duì)產(chǎn)黃酮馬齒莧內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究仍比較少。
本研究從馬齒莧中分離出內(nèi)生真菌，以黃酮類化合物顯色反應(yīng)和紫外光譜特征對(duì)內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物初步鑒定，篩選出產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌，擴(kuò)增其 18S rDNA 序列，并結(jié)合菌落和分生孢子的形態(tài)特征，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，并采用濾紙片法，測試其代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，探究其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌最小抑菌濃度。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗(yàn)所用野生馬齒莧采自于陜西省延安市棗園鎮(zhèn)( N36°37'22. 11″，E109°25'44. 09″) ，用無菌采樣袋避光運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，材料需當(dāng)天開展試驗(yàn)使用。
1.1.1 指示菌株
試驗(yàn)所用金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 、大腸桿菌( Escherichia coli) 由延安大學(xué)資源與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室提供。
1.1.2 主要儀器
GR110DA 滅 菌 器 ( 廈 門 致 微 儀 器 有 限 公司) ，UV-1780 紫外可見光分光光度計(jì)( 日本島津) ，T960 型 PCR 儀( 力康生物科技有限公司) ， RE-5298 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 上海昕儀儀器儀表有限公司) 。
1.1.3 培養(yǎng)基
馬鈴薯葡 萄 糖 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 ( potato dextrose agar，PDA) : 馬鈴薯 200. 0 g，葡萄糖 20. 0 g，蒸餾水 1 000. 0 mL，pH 自然，121 ℃滅菌 20 min，配制固體培養(yǎng)基時(shí)，則需另加入 15. 0～20. 0 g 瓊脂粉。
PYG 培養(yǎng)基( peptone yeast glucose broth) : 牛肉膏 3. 0 g，蛋白胨 5. 0 g，酵母膏 0. 2 g，葡萄糖 5. 0 g，NaCl: 0. 5 g，MgSO4·7H2O: 1. 5 g，蒸餾水 1 000. 0 mL，pH 7. 2 ～ 7. 5，121 ℃ 滅菌 20 min，配制固體培養(yǎng)基時(shí)，則需另加入 15. 0～20. 0 g 瓊脂粉。
水瓊 脂 培 養(yǎng) 基: 瓊 脂 粉 17. 0 g，蒸 餾 水 1 000. 0 mL，121 ℃滅菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 樣品的表面消毒
將采集馬齒莧的根和莖用無菌水進(jìn)行多次沖洗，去除表面塵土，待表面干燥，進(jìn)行表面消毒處理，莖使用體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇溶液消毒 40 s，然后再使用體積分?jǐn)?shù)為 3% 次氯酸鈉溶液消毒 4 min，根使用體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇溶液消毒 30 s、然后再使用體積分?jǐn)?shù)為 3%次氯酸鈉溶液消毒 2 min。樣品表面消毒完全后，備用。
1.2.2 內(nèi)生真菌的分離、純化
用無菌水沖洗消毒完全的莖和根 3 次，最后一次沖洗植物組織的無菌水用移液槍吸取 30. 0 μL移入 PYG、PDA 平板中，用涂布器涂抹均勻，以此作為對(duì)照組。將消毒完全的莖和根與滅菌石英砂一起研磨，加入 10. 0 mL 的無菌水制成懸液，依次進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為: 10、102 、103 、 104 、105 、106 ，將稀釋好的懸液 30. 0 μL 分別涂布在 PDA 固體培養(yǎng)基上，28 ℃，培養(yǎng) 5 d，每個(gè)梯度設(shè)置 3 個(gè)平行對(duì)照，以氣生菌絲和營養(yǎng)菌絲的形態(tài)、長度和顏色為分類依據(jù)，挑取菌絲，轉(zhuǎn)接到新的 PDA 固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行菌種純化，菌株編號(hào)依次為: AG-1、AG-2、AG-3、……AG-n。
1.2.3 內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物提取
將所分 離 純 化 的 馬 齒 莧 內(nèi) 生 真 菌 接 種 至 PDA 液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，28 ℃，160 r/min，發(fā)酵7 d，發(fā)酵液體積為 2. 0 L，待發(fā)酵完畢，四層紗布過濾發(fā)酵液，除去菌絲，將濾液 100 ℃ 水浴加熱，濃縮至 50. 0 mL，濃縮液先用 50. 0 mL 石油醚除去脂質(zhì)等雜質(zhì)，然后再用乙酸乙酯分 3 次萃取濃縮液中馬齒莧內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物，濃縮液與萃取劑的體積比始終保持 1 ∶ 1，合并 3 次萃取劑，65 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙酸乙酯，蒸發(fā)至近干后用 20. 0 mL 甲醇溶解固體物質(zhì)，過 0. 45 μm 有機(jī)系濾膜，揮干甲醇備用[11]。
1.2.4 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌篩選
參考《天然藥物化學(xué)( 第 6 版) 》中黃酮類化合物顯色反應(yīng)[12]，對(duì)所提取的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行顯色反應(yīng)，所選擇的黃酮類化合物顯色反應(yīng)為: 硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)、鹽酸鋅粉反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、氫氧化鈉反應(yīng)、乙酸鎂反應(yīng)。并對(duì)符合黃酮類化合物顯色反應(yīng)的菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行紫外光譜掃描[13]，紫外光譜用甲醇作為參比溶液，建立基線，檢測波長為 200 nm～800 nm，掃描速度為高速，狹縫寬設(shè)置為 2. 0，獲得光譜。符合黃酮類化合物顯色反應(yīng)和紫外光譜圖特征的菌株代謝產(chǎn)物，可認(rèn)為該菌株能夠產(chǎn)黃酮，上述反應(yīng)中以蘆丁為陽性對(duì)照，以無菌水為陰性對(duì)照。
1.2.5 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌鑒定
采用光學(xué)顯微鏡對(duì)產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌進(jìn)行形態(tài)觀察，首先，將內(nèi)生真菌接種在水瓊脂培養(yǎng)基上，將無菌蓋玻片傾斜插入菌落四周，28 ℃，培養(yǎng) 4 d，待到菌絲生長至蓋玻片上時(shí)，取出蓋玻片，滴加棉蘭染液染色在顯微鏡下觀察，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征對(duì)照《普通真菌學(xué)》、《半知菌分屬圖冊(cè)》進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)分類鑒定[14-15]。
使用 ITS1、ITS4 引物，擴(kuò)增菌株 18S rDNA 序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，總 DNA 提取使用索萊寶公司生產(chǎn)的真菌基因組 DNA 提取試劑盒( Fungi Genomic DNA Extraction Kit) ，擴(kuò)增 18S rDNA 序列所使用的引物為 ITS1( 5'-CTTCGTCATTAGAGAAGTAA-3') ，ITS4 ( 5-TCCTCCGCTTAGATATGC-3 ) ， PCR( polymerase chain reaction) 反應(yīng)體系和條件參照康為世紀(jì)生產(chǎn) 2×Taq MasterMix( Dye) 所提供的反應(yīng)體系和條件，94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 40 s，55 ℃ 退火 40 s; 72 ℃ 延伸 50 s，35 個(gè)循環(huán)， 72 ℃終延伸 10 min，4 ℃低溫保存。
PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠，90 V 水平電泳 30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢查擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果在 NCBI( national center for biotechnology information) 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，使用軟件 MEGA-X 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并將測序結(jié)果上傳至 GenBank，申請(qǐng)菌株序列登錄號(hào)。
1.2.6 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測定
采用濾紙片法對(duì)產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測試，待測內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物 1. 0 g，溶于 100. 0 mL 水中，此時(shí)質(zhì)量濃度為 10. 0 mg /mL，并稀釋成質(zhì)量濃度為 0. 5 mg /mL、1 mg /mL、2 mg /mL、5 mg /mL 的溶液備用。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌用無菌水配制成 OD600 = 1. 00 的指示菌菌 懸 液，30 μL 涂 布 在 PYG ( peptone yeast glucose broth) 固體培養(yǎng)基上，將浸潤在各個(gè)濃度代謝產(chǎn)物溶液中的濾紙片放在涂布過指示菌的 PYG 固體培養(yǎng)基上，28 ℃，培養(yǎng) 4 d，測量抑菌圈直徑。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置 3 個(gè)平行對(duì)照，以無菌水為空白對(duì)照，指示菌為金黃色葡萄球菌，為革蘭氏陽性菌，故陽性藥物 1 選用青霉素; 大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，故陽性藥物 2 選用頭孢唑林鈉。選用等濃度的青霉素和頭孢唑林鈉作為陽性對(duì)照。
2 結(jié) 果
2.1 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌篩選
2.1.1 內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物顯色反應(yīng)
使用 PDA 固體培養(yǎng)基從馬齒莧根和莖中分離得到 5 株代謝產(chǎn)物與黃酮顯色反應(yīng)相似的菌株，如表 1 所示。其中菌株 AG-10 和 AG-7 硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)為陽性，菌株 AG-10 在所進(jìn)行的顯色試驗(yàn)中均呈陽性，初步鑒定菌株 AG-10 代謝產(chǎn)物為黃酮類化合物。
2.1.2 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物紫外光譜檢測
黃酮類化合物的甲醇溶液普遍在 200 nm ～ 400 nm 會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)峰帶，即 300 nm～400 nm 峰帶 Ⅰ和 220 nm～280 nm 峰帶Ⅱ[12]，以黃酮類代表物質(zhì)蘆丁紫外光譜圖為對(duì)照，對(duì)菌株 AG-10 代謝產(chǎn)物進(jìn)行紫外光譜分析，結(jié)果如圖 1 所示，菌株 AG10 在 376. 0 nm 處 有 弱 吸 收 峰，在 269. 0 nm、 219. 0 nm、207. 0 nm 處有 3 個(gè)明顯的吸收峰，蘆丁在 357. 6 nm、256. 6 nm、206. 0 nm 處有 3 個(gè)明顯吸收峰，蘆丁和菌株 AG-10 代謝產(chǎn)物均在 300 nm～400 nm 和 220 nm～280 nm 出現(xiàn)吸收峰，這與黃酮類化合物吸收峰特征相符，結(jié)合顯色試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果，進(jìn)一步說明菌株 AG-10 代謝產(chǎn)物中含有黃酮類物質(zhì)。
2.2 菌株鑒定
AG-10 菌絲前期呈白色，后期呈淺黃色，菌絲稀疏平鋪較長，菌落背面為淺黃棕色，菌落中間厚邊緣略薄，分生孢子梗細(xì)長，分支，孢子鐮刀形，無色; 18S rDNA 序列 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 550 bp，測序結(jié)果在 NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，結(jié)果顯示 AG-10 與 Fusarium oxysporum ( JX045827 ) 18S rDNA 序列相似性為 99%，選擇 18S rDNA 序列相似性大于 99%的菌株序列，使用 MEGA-X 軟件，采用 N-j 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)合菌株的形態(tài)特征和 18S rDNA 序列，初步鑒定 AG-10 為鐮 孢 霉 ( Fusarium sp.) ，測序結(jié)果上傳至 GenBank 申請(qǐng)序列登錄號(hào): MK951708。
2.3 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測定
參考抑菌圈實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn): 抑菌圈直徑> 20 mm 屬于極敏感，15 ～ 20 mm 屬于高敏感，10 ～ 15 mm 屬于中敏感，7～ 9 mm 屬于低敏感，抑菌圈直徑< 7 mm屬于不敏感[16]。
AG-10 內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物抑菌活性結(jié)果如表 2、表 3 所示，代謝產(chǎn)物抑菌效果隨著代謝產(chǎn)物濃度的增加而增加。代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為1. 0 mg /mL 時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，但效果不明顯，對(duì)大腸桿菌無抑菌作用; 代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為 2. 0 mg /mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌作用，抑菌圈直徑在 4～6 mm 范圍內(nèi)，屬于不敏感，對(duì)大腸桿菌有抑菌作用，但效果不明顯; 代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為 5. 0 mg /mL 時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用，抑菌圈直徑在 10 ～ 13 mm 范圍內(nèi)，屬于中敏感，對(duì)大腸桿菌有抑菌作用，抑菌圈直徑在 7 ～ 9 mm 范圍內(nèi)，屬于低敏感; 代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為 10. 0 mg /mL 時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌有十分明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑在 17～19 mm 范圍內(nèi)，屬于高敏感，對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑在 12～ 14 mm 范圍內(nèi)，屬于中敏感。AG-10 代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為 1. 0 mg /mL，對(duì)大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為 2. 0 mg /mL。
3 討 論
據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，趙慶云等[17]利用 HLPC-UV 技術(shù)從銀杏中分離、篩選出 7 株產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌，結(jié)合內(nèi)生真菌菌絲形態(tài)和孢子特征，鑒定為匐柄霉、叢梗孢屬、交鏈孢屬、鐮孢霉屬、赤霉屬、蜜孢霉、和暗梗單孢霉屬。張海龍等[18]通過顯色反應(yīng)、薄層層析( thin layer chromatography，TLC) 、高效液相色譜法( high-performance liquid chromatograhy， HPLC) 從銀杏中分離得到兩株產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌，卷枝毛霉和尖鐮孢霉。騰艾靜等[13]對(duì)苣荬菜中黃酮類化合物的抑菌活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，苣荬菜中黃酮類化合物對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，最小抑菌質(zhì)量濃度為 0. 5 mg /mL。
本研究從馬齒莧根內(nèi)篩選出一株產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌 AG-10，通過形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合 18S rDNA 序列，鑒定為鐮孢霉菌。AG-10 代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌作用，最小抑菌質(zhì)量濃度分別為 1. 0 mg /mL 和 2. 0 mg /mL，且抑菌活性與濃度存在一定的量效關(guān)系，隨濃度增加，抑菌活性也呈正比例關(guān)系逐漸增加。AG-10 代謝產(chǎn)物的抑菌活性與等濃度的青霉素與頭孢唑林鈉相比效果較弱，可能是由于未對(duì) AG-10 代謝產(chǎn)物進(jìn)行純化，代謝產(chǎn)物成分較為復(fù)雜。下一步可對(duì) AG-10 代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化，以期獲得高純度的抑菌活性物質(zhì)。
馬齒莧中黃酮的藥理學(xué)研究已逐漸成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)，有研究表明，馬齒莧中的黃酮類化合物具有抗菌消炎、降脂等多種作用，本研究中 AG10 黃酮類代謝產(chǎn)物與馬齒莧植源型黃酮類化合物是否具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，還有待研究。下一步應(yīng)對(duì) AG-10 菌株進(jìn)行生理特性研究和菌體內(nèi)黃酮代謝途徑的研究。在初步分離的內(nèi)生真菌中，AG-4、AG-5、AG-7 和 AG-9 四株菌代謝產(chǎn)物黃酮類顯色反應(yīng)中有一種或幾種微弱的陽性反應(yīng)，有可能是發(fā)酵液中黃酮含量較低，代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜，從而影響顯色反應(yīng)結(jié)果，因此下一步研究應(yīng)采取高效液相( HPLC) 、質(zhì)譜( mass spectrometry，MS) 、核 磁 共 振 ( nuclear magnetic resonance，NMR) 等方法[19]，對(duì)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析，將產(chǎn)黃酮類真菌的代謝產(chǎn)物一一分離，得到單體化合物。并通過發(fā)酵條件和工藝優(yōu)化等方法和手段，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，使利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)成為可能。
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4 結(jié) 論
本研究從馬齒莧中分離內(nèi)生真菌，以黃酮類化合物顯色反應(yīng)和紫外光譜特征對(duì)內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定，篩選出產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌 AG10，經(jīng)鑒定 AG-10 鐮孢霉，其代謝產(chǎn)物可抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，最小抑菌質(zhì)量濃度分別為 1. 0 mg /mL 和 2. 0 mg /mL。——論文作者：艾加敏，余天飛，李 靜，姜影影，柳曉東，鄧振山*
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