發(fā)布時(shí)間：2021-04-26所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：腎俞、足三里為針刺治療骨質(zhì)疏松癥的常用穴位，但其具體機(jī)制尚不明確。目的：基于骨組織Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2啟動(dòng)子甲基化水平，探究電針腎俞、足三里等穴位對去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的療效機(jī)制。方法：將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針穴位
摘要背景：腎俞、足三里為針刺治療骨質(zhì)疏松癥的常用穴位，但其具體機(jī)制尚不明確。目的：基于骨組織Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2啟動(dòng)子甲基化水平，探究電針腎俞、足三里等穴位對去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的療效機(jī)制。方法：將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針穴位組、電針非穴位組、雌二醇組，每組10只。假手術(shù)組以外的4組大鼠采用去卵巢法建立骨質(zhì)疏松癥模型，電針穴位組選取腎俞、足三里穴位進(jìn)行電針治療，電針非穴位組選取非穴位處進(jìn)行干預(yù)，其余3組不進(jìn)行電針干預(yù);雌二醇組給予雌二醇片(0.09mg/kg)灌胃治療，假手術(shù)組和模型組均灌胃10mL/kg的生理鹽水。干預(yù)12周后，測定各組大鼠右側(cè)下肢股骨及椎骨骨密度、股骨生物力學(xué)性能、血清骨鈣與Ⅰ型原膠原N端前肽表達(dá)水平、骨組織骨橋蛋白與骨唾液蛋白表達(dá)水平、骨組織Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2啟動(dòng)子甲基化表達(dá)水平。結(jié)果與結(jié)論：①與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨、椎骨骨密度明顯下降(P<0.05);股骨最大載荷、剛度及彈性模量、血清骨鈣、Ⅰ型原膠原N端前肽水平均明顯下降(P<0.01);骨組織中骨橋蛋白和骨唾液蛋白、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2啟動(dòng)子CpG1和CpG2、CpG3和CpG4.5的表達(dá)明顯上升(P<0.01);②與模型組相比，電針穴位組和雌二醇組對上述各指標(biāo)改善明顯(P<0.01);而電針非穴位組骨組織中Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2啟動(dòng)子CpG1、CpG2、CpG3、CpG4.5的表達(dá)下降不明顯(P>0.05)，此外其余上述指標(biāo)均有所改善(P<0.05);③與雌二醇組相比，電針穴位組對血清Ⅰ型原膠原N端前肽水平的上調(diào)較為明顯(P<0.05)，而其余指標(biāo)差異無顯著性意義(P>0.05);④提示電針腎俞、足三里穴位可通過降低骨組織Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2啟動(dòng)子甲基化水平，增強(qiáng)骨密度，改善股骨的生物力學(xué)性能等，從而有效防治骨質(zhì)疏松癥。
關(guān)鍵詞：電針;骨質(zhì)疏松;表觀遺傳;甲基化;生物力學(xué);大鼠;Runx2啟動(dòng)子
0引言Introduction
骨質(zhì)疏松癥是以患者單位體積內(nèi)骨量減少為主要特點(diǎn)的代謝性骨病，中老年人為其常見患病群體[1]。作為骨質(zhì)疏松癥最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，骨質(zhì)疏松性骨折致殘率高，是造成老年人生活質(zhì)量下降的主要原因及常見的死亡原因[2-3]。調(diào)查顯示，國內(nèi)65歲以上居民的骨質(zhì)疏松癥患病率為32%[4]，而絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥占比最大[5]，臨床上對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療以雌激素替代療法為主，但長期使用會增加女性患乳腺癌、宮頸癌等的概率[6]。
DNA甲基化所屬的表觀遺傳修飾是一種重要的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，異常的DNA甲基化在癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫疾病、骨質(zhì)疏松癥等許多疾病中存在，影響癌癥形成和腫瘤進(jìn)展[7]�，F(xiàn)有研究表明，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runtrelatedtranscriptionfactor2，Runx2)基因啟動(dòng)子甲基化水平的高低是成骨細(xì)胞分化和骨形成的重要影響因素，影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展[8-9]。
相關(guān)期刊推薦：《中國組織工程研究與臨床康復(fù)》1997年創(chuàng)刊，由中華人民共和國衛(wèi)生部主管，中國康復(fù)醫(yī)學(xué)會與《中國組織工程研究與臨床康復(fù)》雜志社主辦。發(fā)表組織工程研究中關(guān)于干細(xì)胞培養(yǎng)與移植、組織構(gòu)建、材料生物相容性評價(jià)(天然或合成材料與納米粒子、人工材料植入體、植入器官及外源性細(xì)胞)、計(jì)算機(jī)輔助骨外科技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)及臨床研究，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和循證醫(yī)學(xué)研究的文章，發(fā)表中國組織工程研究領(lǐng)域一流水平的學(xué)術(shù)、技術(shù)創(chuàng)新成果。
基于中醫(yī)“腎主骨”理論指導(dǎo)，針刺腎俞穴可培腎壯骨，固護(hù)人體先天之本，針刺足三里可健脾胃，固護(hù)后天之本，從而促進(jìn)腎精形成[10]。故臨床上通過電針腎俞、足三里穴位將補(bǔ)腎之法廣泛運(yùn)用于骨質(zhì)疏松癥的治療中[11]，目前多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)針刺腎俞、足三里等穴位能夠刺激骨密度明顯增加，改善骨骼的生物力學(xué)形態(tài)[12-13]，但具體機(jī)制不甚明確。而研究發(fā)現(xiàn)通過針刺腎俞、足三里能促進(jìn)腰椎中Runx2mRNA表達(dá)[10]，由此推測電針腎俞、足三里可能通過影響Runx2基因啟動(dòng)子甲基化以防治骨質(zhì)疏松癥。
故此次研究基于骨組織Runx2基因啟動(dòng)子的甲基化修飾，探究針刺對去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的療效機(jī)制。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設(shè)計(jì)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。
1.2時(shí)間及地點(diǎn)于2018年12月至2019年12月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。
1.3材料
1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只成年SD大鼠，SPF級，雌性，體質(zhì)量160-220g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量生產(chǎn)合格證號：SCXK(粵)2018-0034。動(dòng)物房溫度為(21±3)℃，濕度50%。此次實(shí)驗(yàn)已通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會批準(zhǔn)。
1.3.2儀器華佗牌電針儀(型號：SDZ-Ⅱ)，廣東省普寧市普慈醫(yī)療器械有限公司;DexaPro-1型雙能X射線骨密度儀，美國GE公司;AllegraX-15R型醫(yī)用離心機(jī)，美國Beckman公司;JS-Power300型電泳儀，上海迪奧生物科技有限公司;ZF-208型凝膠成像，上海恒勤儀器設(shè)備有限公司;PIDRed96型PCR儀，美國ThermoFisherScientific公司。
1.3.3藥品和試劑戊酸雌二醇片(廊坊高博京邦制藥有限公司，批號：20181112，規(guī)格：2mg/片);血清骨鈣、Ⅰ型原膠原N端前肽(totalprocollagentype1N-propeptide，P1NP)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號：ZN1686238，ZN16730102);水合氯醛溶液(批號：jx-1480);二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(批號：jx-2468);聚丙烯酰胺凝膠試劑盒(批號：jx-2391);羊抗鼠骨橋蛋白一抗(批號：jx-2566);羊抗鼠骨唾液蛋白一抗(批號：jx-2686);甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(批號：jx-2583);實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(批號：jx-2465)。
1.4實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1動(dòng)物分組、造模選擇50只6月齡健康雌性SD大鼠，經(jīng)1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即假手術(shù)組、模型組、電針穴位組、電針非穴位組及雌二醇組，每組10只。假手術(shù)組以外的其余4組大鼠采用去卵巢法建立骨質(zhì)疏松癥模型[14]，麻醉后，在大鼠腰椎旁開1cm處，沿皮膚及肌肉縱向剖離1.5cm左右深度，在脂肪團(tuán)中找到并切除雙側(cè)卵巢;假手術(shù)組采用同樣的手術(shù)操作暴露但不摘除卵巢。5組大鼠術(shù)后每日均予腹腔注射10×104U青霉素，連續(xù)給藥3d，防止感染。
1.4.2干預(yù)方法正常飼養(yǎng)術(shù)后大鼠，2個(gè)月后開始進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)干預(yù)12周。電針穴位組固定大鼠并進(jìn)行常規(guī)消毒，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選取腎俞、足三里穴位[15]，用0.35mm×25mm毫針平刺4.0-5.0mm后，連接電針儀，進(jìn)行治療，頻率為2Hz，強(qiáng)度為1mA，連續(xù)波，每日早晚各1次，每次持續(xù)10min;電針非穴位組選取非穴位處(脅下髂嵴上20-25mm，后正中線旁開20mm處)，操作同電針穴位組;其余3組不進(jìn)行電針干預(yù)，但予相同的固定操作。雌二醇組給予雌二醇片(0.09mg/kg)灌胃治療[16]，1次d，給藥12周;假手術(shù)組和模型組均灌胃10mL/kg的生理鹽水，1次/d，給藥12周。
1.5主要觀察指標(biāo)
1.5.1骨密度末次給藥結(jié)束后24h，注射10%水合氯醛(3mL/kg)至腹腔，麻醉大鼠后，將大鼠右股骨、椎骨部位置于雙能X射線密度儀器上檢測骨密度。
1.5.2股骨生物力學(xué)性能將大鼠麻醉后斷頭處死，取各組大鼠完整的股骨，放置于生物力學(xué)萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)上，機(jī)器以2mm/min速度往下壓，直至股骨斷裂。采集數(shù)據(jù)，測得最大載荷、股骨剛度、彈性模量的數(shù)值。
1.5.3血清骨鈣、P1NP的水平從大鼠的腹主動(dòng)脈收集血液5mL，放置1h，以3000r/min離心10min，分離得到血清。按ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中骨鈣、P1NP的表達(dá)水平。
1.5.4骨組織骨橋蛋白、骨唾液蛋白大鼠處死后，取右側(cè)股骨洗凈，取部分骨片研磨、提取蛋白，用二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品加到聚丙烯酰胺凝膠的孔內(nèi)，每孔20μL，用280mA電流轉(zhuǎn)膜1h。取出PVDF膜，TBST洗3次，5min/次，之后將膜放入5%的脫脂奶粉中，室溫條件下封閉保存2h。封閉結(jié)束后，將膜取出，TBST浸洗3次，5min/次，加入骨橋蛋白、骨唾液蛋白的一抗(1∶1000)稀釋液，4℃儲存，過夜。加入二抗(稀釋度為1∶200)，以ECL試劑盒顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像并采用ImageJv1.5.1軟件分析，以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的灰度值比值表示該蛋白的相對表達(dá)量。
1.5.5Runx2啟動(dòng)子甲基化水平取雙側(cè)股骨頭，除雜、清洗并干燥后，裝入液氮凍存管，擰緊管蓋，液氮速凍0.5h后，于-80℃冰箱中凍存。質(zhì)譜法檢測：①引物設(shè)計(jì)：檢測部位為Runx2基因啟動(dòng)子CpG1、CpG2、CpG3和CpG4.5(表1)。②引物設(shè)計(jì)完成后，再經(jīng)過DNA提取(使用QIAGEN試劑盒提取骨組織DNA)、重亞硫酸鹽處理、PCR擴(kuò)增、堿性磷酸酶處理、體外轉(zhuǎn)錄(IVT)和RNase酶切、純化，點(diǎn)樣及質(zhì)譜。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以x-±s表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，用單因素方差分析(OneWayANOVA)比較各組數(shù)據(jù)，組間兩兩比較則采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表明差異有顯著性意義。
2結(jié)果Results
2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析健康雌性SD大鼠共50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠均無死亡。
2.2電針對骨質(zhì)疏松大鼠股骨、椎骨骨密度的影響在大鼠股骨、椎骨骨密度方面，模型組顯著低于假手術(shù)組(P<0.05);與模型組相比，電針非穴位組大鼠的股骨、椎骨骨密度顯著升高(P<0.05)，而電針穴位組和雌二醇組升高更加明顯(P<0.01)，但兩組間比較差異無顯著性意義(P>0.05)，見表2。
2.3電針對骨質(zhì)疏松大鼠生物力學(xué)性能的影響由表3可知，在股骨最大載荷、股骨剛度、彈性模量方面，模型組顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)，表明造模成功。與模型組比較，電針非穴位組股骨最大載荷、股骨剛度、彈性模量顯著升高(P<0.05)，而電針穴位組和雌二醇組升高更加明顯(P<0.01)。與電針非穴位組比較，電針穴位組和雌二醇組的股骨最大載荷、股骨剛度、彈性模量升高明顯(P<0.05)。表明經(jīng)過電針干預(yù)后，療效明顯。
2.4電針對骨質(zhì)疏松大鼠骨鈣、P1NP表達(dá)的影響在血清骨鈣水平上，模型組顯著低于假手術(shù)組(P<0.01);與模型組比較，電針非穴位組的表達(dá)升高(P<0.05)，電針穴位組和雌二醇組的表達(dá)升高更加明顯(P<0.01)。與電針非穴位組比較，電針穴位組和雌二醇組的表達(dá)升高(P<0.05)，詳見表4。
在P1NP表達(dá)方面，模型組顯著低于假手術(shù)組(P<0.01);與模型組比較，電針非穴位組的表達(dá)升高(P<0.05)，電針穴位組和雌二醇組的表達(dá)升高更加明顯(P<0.01)。與電針非穴位組比較，電針穴位組的表達(dá)升高(P<0.05)。和雌二醇組相比，電針穴位組升高更加明顯(P<0.05)，詳見表4。
2.5電針對骨質(zhì)疏松大鼠骨橋蛋白、骨唾液蛋白表達(dá)的影響由表5及圖1可知，在骨橋蛋白、骨唾液蛋白表達(dá)方面，模型組顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，表明造模成功。與模型組比較，電針非穴位組的表達(dá)降低明顯(P<0.05)，而電針穴位組和雌二醇組降低更加明顯(P<0.01)。表明經(jīng)過電針干預(yù)后，療效明顯。
2.6電針對骨質(zhì)疏松大鼠Runx2啟動(dòng)子CpG1、CpG2、CpG3和CpG4.5表達(dá)的影響詳見表6。
由表6可見，在Runx2啟動(dòng)子CpG1、CpG2、CpG3和CpG4.5表達(dá)方面，模型組顯著高于假手術(shù)組(P<0.01);與模型組比較，電針非穴位組的表達(dá)下降不明顯(P>0.05)，電針穴位組和雌二醇組下降明顯(P<0.05)。
3討論Discussion
通過癥狀對比，骨質(zhì)疏松癥與中醫(yī)學(xué)中的“骨痹”“骨痿”相似�！端貑�·陰陽應(yīng)象大論》曰：“腎生骨髓，在體為骨”，腎精、氣虛則骨髓不生，髓減則骨痿，故治療多補(bǔ)腎益精[17]。足太陽膀胱經(jīng)之腎俞穴，為腎氣輸注于背部之處,針之培腎壯骨，固護(hù)人體先天之本�！夺t(yī)宗金鑒》曰：“多氣多血惟陽明”，足陽明胃經(jīng)之足三里，為胃經(jīng)之下合穴，針之健脾益胃，故針刺足三里能固護(hù)后天之本，補(bǔ)益氣血，促精形成[10]。目前研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎健脾針刺療法對骨質(zhì)疏松癥患者療效明顯[18]，針刺足三里、腎俞能抑制破骨細(xì)胞的骨吸收[19]，增加骨密度、提高骨形成、增強(qiáng)骨強(qiáng)度[13]，通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞骨吸收與成骨細(xì)胞骨的動(dòng)態(tài)平衡，可達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的目的，但現(xiàn)有研究未闡明其具體機(jī)制。
表觀遺傳修飾研究的是基因序列不變，產(chǎn)生可遺傳的基因表達(dá)改變，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、微小RNA(miRNA)等[20]。其中DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將甲基基團(tuán)可逆性轉(zhuǎn)移到基因組鳥苷酸(CpG)二核苷酸上[21]，啟動(dòng)子序列DNA甲基化抑制基因表達(dá)[22]。間充質(zhì)干細(xì)胞是成骨細(xì)胞的來源，研究表明，DNA甲基化能夠調(diào)控多種成骨、破骨基因的表達(dá)，其中關(guān)鍵基因啟動(dòng)子的甲基化在間充質(zhì)干細(xì)胞在向成骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞的過程中起抑制作用，進(jìn)而影響成骨、破骨細(xì)胞的活性與分化，影響成骨的發(fā)生發(fā)展[23-25]。與此同時(shí)，研究表明骨細(xì)胞感受機(jī)械刺激后亦能抑制間充質(zhì)干細(xì)胞成骨基因甲基化，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及骨形成[9]。而作為成骨細(xì)胞形成的中心環(huán)節(jié)，Runx2可調(diào)控骨鈣、骨橋蛋白、骨唾液蛋白、Ⅰ型膠原等多種重要成骨細(xì)胞表型基因的表達(dá)[26-29]。現(xiàn)有研究表明，去卵巢造成骨組織Runx2啟動(dòng)子高甲基化，抑制其轉(zhuǎn)錄，下調(diào)其表達(dá)，從而下調(diào)多種成骨細(xì)胞表性基因的表達(dá)，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[30]。目前已有研究表明，鹿茸中藥復(fù)方、補(bǔ)腎中藥復(fù)方、仙靈骨葆膠囊等具有補(bǔ)腎功效的中藥復(fù)方能夠降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨組織的Runx2啟動(dòng)子甲基化水平，上調(diào)Runx2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨[30-31]。
目前基于中藥、針灸防治骨質(zhì)疏松癥的臨床研究與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)很多，但是明確針對電針腎俞、足三里與Runx2甲基化的研究仍然較少，Runx2作為影響骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的重要因素[32-37]，電針通過影響其甲基化防治骨質(zhì)疏松癥的具體作用機(jī)制仍待深入研究。
此次研究結(jié)果顯示，通過電針具備補(bǔ)腎功效的腎俞、足三里，能夠升高骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨組織中骨密度，明顯改善股骨最大載荷、剛度及彈性模量，升高血清骨鈣、P1NP的含量，下調(diào)骨橋蛋白、骨唾液蛋白及Runx2啟動(dòng)子CpG1、CpG2、CpG3、CpG4.5的表達(dá)，這提示電針腎俞、足三里等穴位可通過降低骨組織Runx2啟動(dòng)子甲基化水平，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而上調(diào)其靶基因骨鈣、Ⅰ型膠原等的表達(dá)，下調(diào)骨橋蛋白、骨唾液蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，增加骨形成與骨骼骨密度，改善股骨最大載荷、剛度及彈性模量等骨骼生物力學(xué)性能，有效降低或延緩骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展。
此次研究結(jié)果中，除血清P1NP水平外，電針穴位組與雌二醇組對其余指標(biāo)的改善并未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不能作為電針腎俞、足三里穴位能夠較雌二醇更有效防治骨質(zhì)疏松癥的有力證據(jù)，且由于骨代謝中各類細(xì)胞分化及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的復(fù)雜性[38]，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證明。
綜上所述，電針腎俞、足三里穴位可通過降低骨組織Runx2啟動(dòng)子甲基化水平，上調(diào)Runx2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨形成，增加骨骼骨密度，改善股骨的生物力學(xué)性能，有效治療骨質(zhì)疏松癥。提示骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制之一或?yàn)楣墙M織Runx2啟動(dòng)子甲基化水平升高;電針腎俞、足三里等穴位或通過降低骨組織Runx2啟動(dòng)子甲基化水平，有效防治骨質(zhì)疏松癥。——論文作者：陳趙1，2，莫雨晴3，唐宏宇4
