發(fā)布時間：2020-04-21所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：為了對石油污染土壤進行更加有效的生物修復，應用統(tǒng)計分析軟件SPSS分析石油污染土壤微生態(tài)環(huán)境構成要素間的典型相關性，優(yōu)化提高微生物生長代謝的環(huán)境條件，并運用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術考察石油污染對土壤微生物群落結構及多樣性的影響。結果表
摘要：為了對石油污染土壤進行更加有效的生物修復，應用統(tǒng)計分析軟件SPSS分析石油污染土壤微生態(tài)環(huán)境構成要素間的典型相關性，優(yōu)化提高微生物生長代謝的環(huán)境條件，并運用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術考察石油污染對土壤微生物群落結構及多樣性的影響。結果表明，土壤中有效的氮、磷質(zhì)量分數(shù)，含水率和石油污染程度是石油降解菌生長繁殖的限制因素，因此在生物修復過程中，投加適量的氮、磷營養(yǎng)，適當?shù)靥岣咄寥篮蕰黾咏到饩鷶?shù)量，可以提高石油污染土壤的修復效率;石油污染土壤中存在常見的石油烴降解菌;石油污染一定程度上使微生物種群趨于單一化和功能化，微生物種群多樣性降低。通過上述研究可為調(diào)控和優(yōu)化石油污染土壤的微生態(tài)環(huán)境以及識別優(yōu)勢群落提供客觀可靠的技術依據(jù)。
關鍵詞：石油污染土壤;微生態(tài)環(huán)境;SPSS;典型相關分析;變性梯度凝膠電泳(DGGE)
石油污染土壤微生態(tài)環(huán)境是指以微生物為主體的生物和非生物因子構成的復合系統(tǒng)，其主要特性是在微生物群落主導下的生物因子與非生物因子之間的相互作用與相互依存關系j。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，土壤中大量的微生物作為分解者幾乎參與了土壤中的一切生物化學反應，它們將有毒的有機物分解或降解成為低毒或無毒的物質(zhì)，是最活躍和具有決定性影響的組分之一，在石油污染土壤微生物修復過程中起著關鍵作用]。土壤受到石油污染以后，土壤的理化性質(zhì)、微生物群落結構、物種多樣性等將受到不同程度的影響。因此，在進行生物修復前，需要對土壤微生態(tài)環(huán)境開展必要的研究。
在石油污染土壤生物修復技術發(fā)展過程中，石油污染土壤的微生態(tài)環(huán)境研究受到廣泛關注。張旭等[3]研究了溫度對包氣帶土層中石油污染物生物降解的影響，發(fā)現(xiàn)溫度是影響包氣帶土層中石油污染物自然衰減的重要因素;賈建麗等口探討了油污土微生態(tài)環(huán)境的非生物因子與微生物活性的關系;劉五星等研究了石油污染對土壤理化性質(zhì)和微生物群落結構及功能多樣性的影響。但是，現(xiàn)有的研究存在試驗樣本量少、環(huán)境因素單一，以及僅考察單因素問的交互作用的問題，存在一定的局限性。
SPSS(Statisticalproductandservicesolutions)是發(fā)展較早、應用非常普遍的社會統(tǒng)計軟件包，其典型相關分析(Canonicalcorrelationanalysis)是研究2組變量間相關關系的一種新型多元統(tǒng)計分析方法。它從2組變量中提取有代表性的2個綜合變量，并利用2個綜合變量之間的相關關系來反映兩組指標之間的整體相關性，起到合理的簡化變量的作用。其基本思想是，首先在每組變量中找出變量的線性組合，使其具有最大相關性;然后再在每組變量中找出第2對線性組合，使其與第一對線性組合不相關，而第二對本身具有最大相關性;如此繼續(xù)下去，直到兩組變量之間的相關性被提取完畢為止。這些綜合變量被稱為典型變量(Canonicalvariates)，第1對典型變量問的相關系數(shù)則被稱為第一典型相關系數(shù)(一般來說，只需提取1～2對典型變量即可較為充分地概括樣本信息)[。該方法在社會統(tǒng)計_5]、醫(yī)療衛(wèi)生]、農(nóng)林牧漁等方面均有廣泛的應用，但在污染環(huán)境的治理，尤其是石油污染土壤生物修復方面的應用鮮見報道。
相關期刊推薦：《石油學報(石油加工)》(雙月刊)1985年創(chuàng)刊，本刊主要刊登有關原油的性質(zhì)與組成、石油加工和石油化工工藝、煉油化工催化劑、燃料和石油化學品及助劑、化學工程、反應動力學、系統(tǒng)工程、環(huán)保、油品分析等方面的基礎理論和應用研究論文及研究結果的綜合述評;優(yōu)先報道這些方面的最新成果。
筆者通過對石油污染土壤調(diào)研取樣，測定土壤的理化性質(zhì)、石油烴含量和微生物數(shù)量等石油污染土壤微生態(tài)環(huán)境構成要素，運用SPSS軟件對這些要素進行典型相關分析，得出影響微生物生長代謝的限制性因子，探討提高微生物活性的機制，并采用PCR—DGGE技術研究石油污染土壤微生物群落結構，為生物修復技術的開發(fā)提供有力的理論依據(jù)。
l實驗部分
1.1土樣采集
從新疆克拉瑪依油田風城油區(qū)及百口泉油區(qū)原油處理污泥池、事故池、鉆井泥漿池及泄油池附近采集64份石油污染土壤。采用棋盤式五點采樣法，取淺層(5～25cm)土壤，每點取樣量大體一致，將各點取出的樣品等質(zhì)量混合，密封后置于冷凍保溫箱中，運回實驗室，于一2O℃保存分析土壤微生物群落結構，4℃保存分析土壤微生物數(shù)量，常溫保存分析土壤理化性質(zhì)。
1.2土樣基本理化性質(zhì)的測定
土樣的基本理化性質(zhì)包括pH值、含水率(質(zhì)量分數(shù))、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、有效氮質(zhì)量分數(shù)、有效磷質(zhì)量分數(shù)、有效鉀質(zhì)量分數(shù)，測定方法參照土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法]。
1.3土樣含油率的測定采用超聲一紅外分光光度法測定
土壤含油率(質(zhì)量分數(shù))l1。
1.4土樣微生物數(shù)量的測定
采用稀釋平板法[11]測定土壤中細菌、真菌、放線菌數(shù)量。參照最大或然數(shù)(Mostprobablenumber，MPN)l】]測定土樣中降油菌數(shù)量。
1.5土樣微生物種群多樣性分析
提取石油污染土壤微生物總DNAn。以細菌16SrDNAV3區(qū)的引物341F(5CGCCCGCCGC—GCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC—CTACGGGAGGCAGCAG一3)和534R(5一ATTACCGCGGCTGCTGG一3)對提取的DNA進行PCR擴增。其反應條件為94℃預變性3min，94C變性1min，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，30個循環(huán)，最后72。C延伸5min。以BIORADDcode系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行DGGE分析口，聚丙烯酰胺膠質(zhì)量分數(shù)為8，變性梯度為40～6O。電泳完畢后，將凝膠置于1mg/LEB的1×TAE緩沖液中染色，將染色后的凝膠用凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像，并用圖形分析軟件QuantityOne對凝膠圖像進行分析。將待測序條帶切下，按前述PCR體系與條件進行擴增，送上海生工生物工程公司純化測序，測序結果輸入Genbank進行比對分析。
利用生態(tài)學的生物多樣性指數(shù)香農(nóng)一威納指數(shù)(Shannon—Weiner，H)對DGGE條帶所表示的微生物種群多樣性進行表征口，判別污染土壤中的微生物多樣性，H數(shù)值越大，種群多樣性越高。其計算公式如式(1)所示。
2結果與討論
2.1石油污染土壤基本性質(zhì)分析結果
表1為石油污染土壤樣品的基本性質(zhì)及含油率。由表1可知，該地區(qū)土壤受到不同程度的石油污染，土壤含油率最高為1o.88，最低為3.13。土壤pH值分布于7.24～7.87之間，屬于弱堿性土壤，這與當?shù)靥厥獾牡乩怼夂蚝退h(huán)境條件造成土壤鹽分積累有關。有研究表明[2]，石油污染會使土壤H值降低，使堿性土壤更接近中性，更有利于土壤中微生物對石油的降解。當?shù)氐拇箨懶愿珊禋夂驅(qū)е峦寥篮实停?.63～6.17之問。土壤有機質(zhì)是指土壤中含碳的有機化合物m]，質(zhì)量分數(shù)為(24.82~97.02)g/kg，一般來講，其含量與土壤的肥力水平呈正相關，但受污土壤中的含油率對有機質(zhì)含量貢獻值較大，不能作為判斷土壤肥力的指標。土壤中3大營養(yǎng)元素(氮、磷、鉀)的有效含量很低，不利于微生物的生長繁殖。石油污染導致土壤中碳含量增加，氮、磷含量相對不足，遠遠低于微生物所需的氮：磷：鉀的營養(yǎng)水平(120：10：1)E]。
2.2石油污染土壤微生物數(shù)量
石油污染土壤微生物數(shù)量測定結果列于表2。由表2可知，細菌的數(shù)量占優(yōu)勢，最高達2.3×10cfu/g;放線菌和真菌的數(shù)量相差不大，較細菌總數(shù)低1個數(shù)量級;降油菌數(shù)量較少，不到細菌總量的1/50。Forsyth等_】。研究表明，在土壤中內(nèi)源性烴降解菌數(shù)量大于10cfu/g時，土壤中石油類污染物降解速率會較快。因此，對該地區(qū)石油污染土壤進行修復必須采取措施增加石油烴降解菌的數(shù)量。
2.3石油污染土壤基本性質(zhì)與微生物數(shù)量之間的典型相關分析
應用統(tǒng)計分析軟件SPSS中附帶的典型相關程序命令對石油污染土壤基本性質(zhì)(含油率xl，pH值x2，含水率x3，有機質(zhì)含量x4，有效氮含量x5，有效磷含量z6，有效鉀含量x7)與土壤微生物數(shù)量(細菌1，放線菌2，真菌3，降油菌y4)的關系進行分析，也就是選2個變量U和V(U為土壤基本性質(zhì)典型變量，V為土壤微生物數(shù)量典型變量)來描述變量z和之間的關系。
由表3給出的石油污染土壤基本性質(zhì)和微生物數(shù)量之間典型相關系數(shù)與維度遞減檢驗可以看出，第1對典型變量U1和V1的典型相關系數(shù)為0.981，第2對典型變量U2和V2的典型相關系數(shù)為0.638，2對典型變量的顯著性檢驗P<0.05，表明相關顯著;第3、4對典型變量的典型相關系數(shù)顯著性檢驗P>0.05不具統(tǒng)計學意義，本研究中不予考慮。綜上所述，石油污染土壤基本性質(zhì)和微生物數(shù)量之間的相關關系可以由第1、2對典型變量來描述。
由表4第1典型變量可知，石油污染土壤基本性質(zhì)第1典型變量U1中起主要作用的是z5和-z6，即有效氮含量、有效磷含量;微生物數(shù)量第1典型變量V1中起主要作用的是4，即降油菌數(shù)量。由此可得出結論，石油污染土壤的有效氮含量和有效磷含量與降油菌數(shù)量關系最大。由土壤基本性質(zhì)測定可知，土壤中有效氮和有效磷含量很低，營養(yǎng)成分是石油降解菌生長繁殖的主要限制因素l_1]。因此在生物修復過程中，投加適量的氮磷營養(yǎng)會增加降解菌數(shù)量，提高石油污染土壤的修復效率。
由表4第2典型變量可知，石油污染土壤基本性質(zhì)第2典型變量U2中起主要作用的是z1、z3，即含油率、含水率;微生物數(shù)量第2典型變量V2中起主要作用的是3，1、4，即細菌數(shù)量、降油菌數(shù)量。由此可知，石油污染土壤的含油率和含水率與細菌總數(shù)和降油菌數(shù)量關系最大，并且土壤含油率與細菌和降油菌數(shù)量呈負相關關系。研究表明E192O]，一定量的石油烴豐富了土壤中的碳源，刺激微生物的生長，同時在污染物的誘導下會產(chǎn)生微生物的種類選擇和優(yōu)勢菌的富集，但當污染物含量超過一定范圍時，又會產(chǎn)生毒性而抑制微生物的活性。所采集樣品的地區(qū)的土壤含油率最高達10.88，對其中細菌和降油菌的生長產(chǎn)生了強烈的抑制作用。當?shù)氐臍夂颦h(huán)境導致土壤的含水率較低，并且石油的強疏水性導致高含油率土壤的疏水性增加，使土壤儲水能力下降，含水率進一步降低¨，更加抑制細菌和降油菌的生長。因此在生物修復過程中，適當提高土壤的含水率有助于提高修復效果。
2.4石油污染土壤微生物群落多樣性分析
從石油污染土壤樣品中選取含油率大于6且石油降解菌數(shù)量較大的3份土壤樣品(A1、A2、A3)與含油率小于6且石油降解菌數(shù)量較大的3份土壤樣品(B1、B2、B3)進行DGGE分析，結果如圖1所示。
根據(jù)DGGE對DNA的分離原理，譜帶上的不同條帶代表該樣品中不同細菌16SrDNAV3區(qū)基因片段_2，條帶信息可初步反映污染土壤的微生態(tài)環(huán)境與微生物種群多樣性的相互關聯(lián)性l2。由圖1可知，6份石油污染土壤樣品經(jīng)DGGE分離得到28個較為明晰的條帶，其中含油率大于6的土樣A1、A2、A3條帶數(shù)目較少，分別為14、10、9;含油率小于6的土樣B1、B2、B3條帶數(shù)目相對較多，分別為23、18、15。
以H值對各石油污染土樣DGGE圖譜所表現(xiàn)的微生物種群多樣性進行分析，結果見表5。
由表5可知，石油污染土壤樣品的H值在2.05～2.90之間，其中含油率大于6的土壤樣品H值均低于2.50，而含油率小于6的土壤樣品H值均大于2.50，說明石油污染物對微生物有抑制作用，一定程度上使微生物種群趨于單一化和功能化，微生物種群多樣性降低。
