發布時間：2020-04-16所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：為研究渤海灣近岸污染對遠近岸海域微生態的影響，利用高通量測序技術，對渤海灣不同離岸距離的6個站位采集表層海水，進行浮游細菌群落結構分析，結合環境、空間因素探究影響其變化的主要因素。結果表明：研究區域存在環境因子的梯度變化，如氮營養鹽在
摘要：為研究渤海灣近岸污染對遠近岸海域微生態的影響，利用高通量測序技術，對渤海灣不同離岸距離的6個站位采集表層海水，進行浮游細菌群落結構分析，結合環境、空間因素探究影響其變化的主要因素。結果表明：研究區域存在環境因子的梯度變化，如氮營養鹽在近岸高于遠岸;細菌α-多樣性在不同站位間差異不顯著，但仍顯示在近岸相對較高;細菌群落結構隨離岸距離變化顯著，γ-變形菌和擬桿菌在近岸顯著富集，且與氮營養鹽的含量有關;藍細菌在遠岸顯著富集，且與氨氮、透明度、電導率有關;鄰體矩陣主坐標單獨解釋部分對群落結構變異的貢獻率最大(38.1%)，說明可能存在尚未測量但具有空間結構的環境變量影響群落空間分布;結合功能預測的結果推測近岸區域的富營養與烴類污染等可能影響群落變化。本文從環境和空間影響兩方面探討了渤海灣不同離岸距離的海域浮游細菌群落結構變化，為研究渤海灣海洋生態及環境保護提供一定的參考。
關鍵詞：渤海灣;浮游細菌群落結構;地理分布;功能預測;鄰體矩陣主坐標
1 引言
渤海灣位于渤海西部，是我國九大海灣之一，周圍集中了海洋化工、港口、灘涂養殖和鹽業等多種經濟活動，是開發利用海洋資源比較活躍的地區之一[1]。隨著城市化進程的加快和臨港工業的發展，陸源排海污染物不斷增加，傾廢、船舶以及海水養殖等對海域生態環境造成巨大壓力[1]。排海污水主要包括耗氧有機物、無機氮、無機磷和油類等，嚴重超標的污染物加之渤海灣為半封閉港灣、與外海交換能力差的特征，導致渤海灣海洋環境質量急劇惡化。微生物作為一類多樣性最高的生命形式，在地球化學循環(碳循環，氮循環，硫循環，磷循環和金屬循環等)中承擔著重要的生態功能，復雜的群落結構、功能、相互作用及其動態變化對環境生態功能的維持有重要意義。海洋微生物群落的結構組成和特性在一定程度上反映了海洋生態系統的環境狀況[2]。深入研究渤海灣微生物群落結構與分布特征對認識和預測渤海灣海洋生態功能極為重要[3]。已有的關于渤海灣微生物多樣性的調查研究主要集中在對浮游細菌數量變化及與環境因子的關系等方面[4–5]，而對海洋細菌群落結構和功能多樣性變化及其受環境和空間因素的影響則少有報道。近年來，越來越多的海洋生態學家開始關注自然環境中空間距離和環境因子在微生物群落結構形成和維持中的作用。在具體的研究中，空間距離代表歷史因素、擴散限制等;環境因素代表當代氣候、物理、化學的環境變化[6]，這兩者被認為是驅動當前微生物多樣性差異的主要因素[7–10]。目前，國內相關的研究主要集中在東海、南海近岸海域，如Xiong等[11]報道了東海沉積物中的細菌群落存在地理分布特征且與氮污染梯度有關系，發現空間距離對細菌群落變化的影響要高于環境因子;同時，Wang等[12]對東海沿岸浙江省區跨越8個海岸帶的表層海水中浮游細菌群落結構變化規律的研究表明，環境和地理因素共同影響部分對該區域浮游細菌群落結構的變化解釋度最高。Zhang等[13]對南海沿海海域400～500km范圍內的總菌群和活性菌群多樣性的分析表明在研究區域內細菌群落存在的地理分布特征是環境和距離衰減共同作用的結果，其中環境因子與群落組成的關系相較于地理距離與群落組成的關系更加緊密。這些研究均顯示在近岸海洋環境中，微生物群落的地理分布規律均分別受空間因素和環境因素的影響，但是針對半封閉港灣的相關研究尚未見報道。
針對渤海灣而言，其地理水文環境與上述海域相比有其獨特性，渤海灣是一種淺灘淤泥質海灣，海底地形自岸向海傾斜，沿岸受人類活動影響較大，半封閉港灣的特征決定了其與外海交換能力差，沿岸各類污染加劇了渤海灣的生態負擔。已有的關于渤海灣微生物生態學研究更加關注浮游細菌豐度和沉積物中細菌群落的變化，如趙海萍等[14]基于浮游細菌的豐度變化對渤海灣浮游細菌分布特征進行研究，為了解渤海灣浮游細菌的生態環境狀況提供了有力的數據支持;另外，劉鵬遠等[15]對渤海灣表層沉積物中細菌群落結構的研究較為全面的探討了海洋環境因素與沉積物微生物群落構成、分布與多樣性的聯系，其重點關注環境因子對表層沉積物群落的影響。目前，對空間因素同環境因素在渤海灣浮游細菌群落變化中的影響作用研究還較為匱乏。為進一步研究渤海灣近岸環境污染對渤海灣近岸及遠岸的海洋微生物生態產生的影響，本文試圖探究渤海灣灣區內從近岸到遠岸接近渤海中央淺海盆地的區域內，隨離岸距離的變化，浮游細菌群落的結構和組成變化，通過對營養鹽等污染物含量和群落的變化進行相關研究，來回答近岸污染對渤海灣沿岸由近及遠的海洋環境微生態的影響程度，并通過方差分解分析地理空間因素和環境因素對該區域細菌群落變化的貢獻，進一步基于群落結構預測該區域微生物功能的空間變化特征，為深入了解微生物群落在渤海灣海洋環境中的生態功能提供參考。
2 材料和方法
2.1海水樣品的采集
2014年8月中旬，采集了渤海灣38.6714°～38.6591°N，117.7273°～118.8841°E范圍內6個站位(圖1)的海水樣品，站位劃分為3個小區域：近岸站位(TJ16、TJ23、TJ27);中間站位(TJ13、TJ17);遠岸站位(TJ14)。每個站點的地理坐標見表1。對每個站位采集1.5L的表層海水(0.5m)樣品。隨船記錄環境參數(水溫、濕度、鹽度、電導率、溶解氧等環境參數)。采集的水樣于采樣船上，每個樣品取500mL用經滅菌處理的100μm孔徑的尼龍布預過濾后用0.2μm孔徑的聚碳酸酯膜(Millipore，USA)過濾，置于預先滅菌容器中存于冰盒，4h內運回實驗室儲存于−80℃冰箱以待后續檢測分析。剩余水樣用于海水水質測定。每個站位采集3個重復。
2.2海水理化性質測定
pH、鹽度、電導率和溶解氧(DO)利用探頭測定(Multi3420，WTW，Germany)，其余理化性質的測定均參照標準方法(GB17378.4—2007)。活性磷酸鹽含量使用鉬藍比色法測定，氨氮含量使用苯酚次氯酸鹽法測定，活性硅酸鹽含量使用硅鉬藍比色法測定，亞硝酸鹽含量使用對氨基苯磺酰胺法測定，硝酸鹽含量則使用Cd-Cu柱還原成亞硝酸鹽后按照亞硝酸鹽含量測定法測定。可溶性總無機氮含量則是通過將氨氮，硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮含量相加獲得。海水中的化學需氧量(COD)使用堿性高錳酸鉀法測定。
2.3細菌基因組提取與目的片段擴增、測序
利用MoBio強力水樣DNA提取試劑盒(MOBIO，USA)對海水樣品進行微生物總DNA提取。利用16SrRNA基因V4區引物：F515(5′–GTGCCAGCMGCCGCGGTAA–3′)和R806(5′–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3′)[16]進行目的片段擴增。擴增子樣品測序前的準備工作參照Illumina公司《16S宏基因組測序文庫制備-為IlluminaMiSeq系統制備16S核糖體RNA基因擴增子》使用說明書進行。擴增后產物利用IlluminaMiseq測序儀進行高通量測序。測序樣品的原始數據已上傳至中國科學院北京基因組研究所大數據中心建立的組學原始數據歸檔庫中，獲取編號為CRA000481，訪問網址：http://bigd.big.ac.cn/gsa。
2.4測序結果分析
測序產生的雙端序列使用FLASH軟件進行拼接，參數默認[17]。拼接后序列使用QIIME軟件進行數據過濾[18]，過濾標準：(1)刪除長度小于200bp和大于450bp的序列;(2)篩選質量大于20(即準確度99%)的序列;(3)最少有連序75%的堿基質量高于20。過濾后的序列，利用USEARCH檢測嵌合體，并使用filter_fasta.py命令將其去除[19]。然后基于條形碼信息對樣本序列進行分配[18]。利用Uclust[19]對優質序列按相似度0.97進行聚類，并將其分配給可操作分類單元(OperationalTaxonomicUnit，OTU)。選取每個OTU中豐度最高的序列作為代表序列。代表序列基于Greengenes數據庫[20]進行分類，使用PyNAST[21]基于Greengenes數據庫進行BLAST比對。清除被分類到葉綠體、線粒體、古生菌、真核生物或未知序列的序列以及單序列。為了保持數據的一致性，對高通量測序數據進行抽平處理，每個樣本隨機選擇3000條序列子集(對應樣本的最小測序量)來計算樣本之間的多樣性、群落組成和群落距離。
2.5統計分析
根據取樣點的地理坐標計算各個站位的離岸距離，對各站位營養鹽含量(主要是COD、無機氮、氨氮、硝態氮、亞硝態氮、活性磷酸鹽、活性硅酸鹽)基于Gower距離進行Cluster聚類分析;利用KruskalWallis秩和檢驗對各站位間的細菌多樣性、優勢物種組成差異進行檢驗;基于Jaccard和Bray-Curtis算法，對各樣本OTU組成數據進行主坐標分析(Principlecoordinateanalysis，PCoA)。
基于取樣點坐標，利用趨勢面分析(trendsurfaceanalysis，Trend)和鄰體矩陣主坐標(principalcoordinatesofneighbourmatrices，PCNM)分析模擬各種可能的空間結構。趨勢面分析是利用數學曲面模擬地理系統要素在空間上的分布及變化趨勢，該方法較為粗放，主要是對數據進行除趨勢處理[22];PCNM分析是基于空間坐標位置，模擬出一系列不同尺度上具有空間自相關的特征值，作為空間變量來解釋不同機制引起的群落結構變化[6,23]。PCNM分析首先構建樣點之間的歐式距離矩陣，削減距離矩陣規模，只保留一定規模的鄰體之間的距離。其次，計算削減距離矩陣的主坐標分析，并保留具有正空間相關的特征向量[6]。最后使用保留的特征向量作為空間變量，運用于多元數據分析當中。PCNM分析可以獲得很多比取樣間隔更寬尺度的正交空間變量，可以對任何類型的空間結構(規則取樣、不規則取樣)進行建模[6]。顯著的PCNM變量可以被定義為寬尺度、中尺度和微尺度變量，一般是任意設定，需要指出的是，隨著PCNM軸的增加，其所代表的空間尺度逐漸減小[23]，但目前尚沒有統一的方法將PCNM變量定義為寬尺度、中尺度和微尺度變量。對于寬尺度和中尺度PCNM變量可以認為是模擬的尚未測量但存在空間結構的微生境變量;微尺度PCNM變量大部分情況是模擬由群落動態產生的局部空間結構，可能與中性生物學過程有關，通常與環境變量沒有關系[6]。
變差分解分析(RariancePartitioningAnalysis，VPA)可以用于評估環境變量與所有尺度的空間變量對響應變量的解釋程度[6]。變差分解的目的是量化各種不同因素單獨或共同解釋響應變量變差的比例，其中，線性趨勢可以視為產生變差的一部分來源。線性趨勢可以發生在響應變量，也可以發生在解釋變量，在進行變差分解之前，需要檢驗線性趨勢的顯著性，如果趨勢顯著，變差分解過程應考慮線性趨勢的影響[6]。結合以上，以環境參數作為環境數據源，浮游細菌群落組成作為生物數據源，基于趨勢面分析和PCNM分析模擬的空間結構作為空間因子數據源，構成環境因子、空間因子與物種組成矩陣，利用VPA分析環境變量和空間變量對浮游細菌群落分布的單獨解釋量和共同解釋量。在進行上述分析之前，對原始環境數據進行對數變換，對物種數據通過海林格變換(Hellingertransform)進行中心變換。在模型構建過程中，分別對環境變量(Env)、Trend和PCNM變量進行前向選擇，即根據R2準則，如果在保留的變量基礎上獲得的校正R2已經等于或者稍大于全模型的校正R2，則停止選擇[6]。
基于線性判別分析流程(lineardiscriminantanalysis(LDA)effectsizepipeline，LEfSe)[24]確定每組的顯著差異分類單元，該流程可在網址：http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/獲取。取LDAscore=2.0(α=0.05)的閾值作為判別標準，選擇one-against-all作為比對方式，對組間相對豐度差異顯著的分類單元進行識別。基于皮爾遜相關系數衡量各變量與差異分類單元之間的關系。利用FAPROTAX工具對微生物群落功能進行預測[25]，基于Bray-Curtis算法對群落功能進行主坐標分析，并基于主坐標分析的聚類結果進行各組別群落功能的差異分析(Kruskal-Wallis秩和檢驗)。
3 結果分析
3.1取樣站位地理環境與海水理化性質分析
結合環境參數(表1)，可以看到取樣站位的水深是遠岸站位最深，中間站位次之，近岸站位最淺。此外，物理環境參數，氣壓、電導率、鹽度的變化隨離岸距離變化不大，溫度(水溫和氣溫)在遠岸站位較低、近岸站位較高，濕度和透明度在遠岸站位較大，近岸站位較小;化學環境參數，總無機氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽含量在遠岸站位較低，近岸站位較高，氨氮含量則在TJ14站位含量最高，其次是TJ27、TJ17，然后是TJ23、TJ13、TJ16，氨氮含量的變化并未隨離岸距離的增大而減小;活性硅酸鹽和活性磷酸鹽含量在近岸站位和遠岸站位相差不大;DO含量在遠岸站位相對高于近岸站位;COD含量則整體上近岸站位高于遠岸站位，但是在遠岸站位中，TJ14的COD含量明顯高于中間站位(TJ13、TJ17)。基于主要營養鹽，如硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮、無機氮、活性磷酸鹽、活性硅酸鹽、COD在各個站位海水樣品中的含量，進行聚類分析，結果顯示6個站位聚成3組，TJ14站位單獨一組，TJ13與TJ17站位聚成一組，TJ16、TJ23與TJ27站位聚成一組(圖2)。主要營養鹽含量的聚類結果，與站位距離具有較高的一致性，該結果表明在本文的研究范圍內，渤海灣的海水水質隨離岸距離呈現出梯度變化的趨勢。
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