發布時間：2020-03-23所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的構建小熱休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表達載體，表達純化融合蛋白.方法在小熱休克蛋白表達載體的基礎上利用點突變方法引入聚精氨酸九肽對應序列，轉入BL21大腸桿菌感受態細胞進行原核表達，利用親和層析方法對表達蛋白進行純化.結果成功構
摘要:目的構建小熱休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表達載體，表達純化融合蛋白.方法在小熱休克蛋白表達載體的基礎上利用點突變方法引入聚精氨酸九肽對應序列，轉入BL21大腸桿菌感受態細胞進行原核表達，利用親和層析方法對表達蛋白進行純化.結果成功構建了融合聚精氨酸九肽的HSP16.5融合蛋白表達載體，并對其在大腸桿菌細胞中的原核表達進行條件優化，研究顯示:在誘導劑IPTG濃度為0.5mmol、37℃條件下誘導4h目的蛋白產量較高.結論此實驗成功構建了小熱休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表達載體，得到了高純度的小熱休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白，為進一步研究其功能奠定基礎.
關鍵詞:熱休克蛋白;聚精氨酸;原核表達;親和層析
熱休克蛋白(Heatshockproteins，HSP)是一類廣泛存在于原核細胞和真核細胞中，與細胞損傷和修復相關的熱應激蛋白質.根據其分子量大小熱休克蛋白分為5類:HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子熱休克蛋白(smallHeatShockProteins，sHSP)[1-2].sHSP能夠通過形成多聚體結構行使其特有功能，如賦予細胞耐熱性和作為分子伴侶協助蛋白質完成折疊、組裝等過程[3].在sHSP眾多成員中，從詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)分離到一種分子量約為16.5kDa的HSP(又稱為HSP16.5)，研究發現:24個HSP16.5單體能夠組裝成外徑12nm、內徑6.5nm的空心球形聚合體[4-5].HSP16.5能自組裝形成中空球形的納米籠結構，其籠內腔可以用來擔載藥物，籠外表面可以引入腫瘤靶向基團，因此，近年來基于HSP16.5納米籠的藥物輸送研究取得了重要進展[6-9].
陽離子多肽是一類主要由含正電荷氨基酸(如賴氨酸、精氨酸)組成的小分子量多肽，由于其富含正電荷，可以通過靜電吸附擔載帶負電荷的核酸(如siRNA和pDNA)類藥物，因此，被廣泛應用于核酸類藥物的輸送體系研發[10-11].在眾多陽離子多肽中，聚精氨酸九肽(R9)研究最為深入.已有多項研究顯示:引入聚精氨酸九肽的納米顆粒能夠吸附負電荷的核酸類藥物，并與之形成穩定的復合體結構.復合體被細胞內吞后隨即釋放，顯示了其在核酸類藥物運輸中的巨大潛力.本研究在HSP16.5表達載體的基礎上對載體進行改造，引入精氨酸九肽對應的DNA序列，構建HSP16.5-R9表達載體，并對其原核表達進行條件優化，最后通過親和層析方法純化融合蛋白，為進一步研究HSP蛋白納米籠的核酸輸送功能奠定基礎.
1材料與方法
1.1試驗材料
PMSF(Sigma公司);IPTG(BBILifeScience公司);氨芐西林、DNA和蛋白質標準品(北京鼎國);質粒提取試劑盒和Ni-NTA親和樹脂(上海生工公司);基因定點突變試劑盒、DNA純化試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術公司);質粒pET21a(+)-HSP由日本九州大學MasaharuMurata惠贈;大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)由本實驗室保存;HeLa和HeLa-EGFP細胞(中科院上海細胞庫).
1.2試驗方法
1.2.1HSP-R9蛋白原核表達載體的構建
根據HSP16.5基因序列設計引物引入R9對應的DNA序列(下劃線):sense引物primer5’AAGAAAGGAATCAACATTGAACGACGACGCCGACGCCGACGCCGTCGACTCGAGCTCCACCACCACC3’;antisenseprimer5’GGTGGTGGTGGAGCTCGAGTCGACGGCGTCGGCGTCGGCGTCGTCGTTCAATGTTGATTCCTTTC3’.利用上述引物進行PCR反應，反應條件:94℃預變性5min，94℃30S，55℃60S，72℃6min，共18個循環，68℃10min.反應結束后，取5μLPCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳;將剩余PCR產物純化后加入DpnΙ進行酶切，以去除模板DNA，37℃孵育30min，取10μL酶切產物轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，次日挑取單克隆搖菌過夜，提取質粒送庫美生物科技有限公司進行測序.
1.2.2HSP-R9融合蛋白的原核表達
將測序正確的pET21(+)-HSP-R9質粒轉入BL21(DE3)大腸桿菌感受態細胞，挑取單克隆接種于20mL的LB培養基中，37℃搖菌過夜;第2天按1∶100接種于1LLB培養基中，當菌液OD600達到0.5～0.6時，加入IPTG(終濃度為1mmol)37℃誘導4h;離心收集菌體，加入細胞裂解液(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，20mmolimidazole，1mmolPMSF)超聲破碎，離心收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE檢測.
1.2.3HSP-R9蛋白的原核表達條件優化
挑取單克隆擴大培養，當菌液OD600nm值達到0.5～0.6時，加入IPTG(終濃度分別為0，0.1，0.2，0.3，0.5，1mmol)37℃誘導4h;離心收集菌體，加入含有尿素的裂解液(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，8molUrea，20mmolImidazole，1mmolPMSF)，離心收集上清液，進行SDS-PAGE檢測.
挑取單克隆擴大培養，當菌液OD600nm值達到0.5～0.6時，加入IPTG(終濃度為0.5mmol)，檢測37℃誘導0，1，2，3，4和6h條件下的蛋白表達情況;離心收集菌體，加入含有尿素的裂解液(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，8molUrea，20mmolImidazole，1mmolPMSF)，離心收集上清液，進行SDS-PAGE檢測.
1.2.4HSP-R9蛋白的親和純化
在菌體裂解液中加入Ni-IDA親和樹脂，轉到孵育30min后離心收集樹脂，然后加入WashBuffer洗滌10次，洗去非特異性結合蛋白，直至洗滌液中不含蛋白為止;將Ni-IDA樹脂加入ElutionBuffer(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，8molUrea，20mmolimidazole，1mmolPMSF)中，室溫孵育30min，離心收集洗脫液，重復洗脫兩次，收集洗脫液;洗脫產物，進行SDS-PAGE檢測.
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2結果與分析
2.1HSP-R9原核表達載體的構建結果
本研究在pET21(+)-HSP表達載體的基礎上，采用點突變方法將R9對應在DNA序列HSP基因的C末端，從而構建HSP-R9的原核表達載體.首先設計突變引物，進行PCR誘導的定點突變:95℃預變性5min，95℃30s、55℃1min、68℃7min，18個循環，然后用限制性內切酶DpnI將模板DNA降解，取酶切產物轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取單克隆提質粒，測序.DNA測序結果見圖1.在HSP基因末端引入了R9對應的DNA序列，且未發現其他位點的突變，提示聚精氨酸對應的DNA序列被成功插入到pET21(+)-HSP載體中.
2.2HSP-R9融合蛋白的原核表達結果
將測序正確的HSP-R9表達載體轉入BL21大腸桿菌感受態細胞中，挑取單克隆擴大培養，待細胞生長至對數生長期后加入誘導劑IPTG，37℃誘導4h檢測目的蛋白表達情況.SDS-PAGE電泳結果見圖2.HSP和HSP-R9融合蛋白均以不溶性的形式存在于菌體裂解液沉淀中，在上清中未發現兩種蛋白的明顯表達.從電泳條帶粗細初步判斷，在同樣表達條件下HSP-R9蛋白表達量較HSP要少.因此，在接下來的操作中，我們采用了含有尿素的裂解液破碎菌體以溶解包涵體.
2.3HSP-R9融合蛋白的原核表達條件優化結果
2.3.1不同IPTG濃度的HSP-R9融合蛋白產量
為獲得HSP-R9蛋白表達的最優條件，我們從誘導劑IPTG濃度和誘導時間兩個因素進行了表達條件優化.結果見圖3.在0.1，0.2，0.3，0.5mmolIPTG誘導下，目的蛋白表達量逐漸增加;然而0.5mmol和1mmolIPTG誘導下的目的蛋白表達量未見明顯增加(第4和第5泳道)，因此，在接下來的研究中我們采用0.5mmolIPTG進行誘導表達.
2.3.2不同誘導時間的HSP-R9融合蛋白產量
誘導時間也是影響原核蛋白產量的重要因素.本研究中，我們檢測了加入誘導劑后37℃誘導0，1，2，3，4，6h的目的蛋白表達情況.表達結果見圖4.誘導0h的菌體裂解液中無目的蛋白表達，誘導1，2，3，4，6h的菌體裂解液中均發現有目的蛋白存在，且隨著誘導時間延長產量逐漸增加.由于誘導4h和6h的菌體裂解液中目的蛋白產量未見明顯區別，因此，在以后擴大生產中采用37℃誘導4h進行.
2.4HSP-R9的蛋白純化結果
由于HSP-R9表達載體上帶有組氨酸標簽，因此，HSP-R9融合蛋白是帶有鎳離子的樹脂利用親和層析的方法進行的蛋白純化.菌體裂解液與NiNTA樹脂結合后，經多次洗滌，去除非特異性結合的蛋白后用高濃度咪唑溶液進行洗脫.結果見圖5.電泳泳道中純化后的HSP和HSP-R9蛋白條帶單一，無明顯可見的蛋白雜帶出現.這說明我們純化的HSP-R9蛋白溶液中目的蛋白純度較高，可用于下一步的功能檢測.
3討論
晶體學研究顯示:24個小熱休克蛋白HSP亞基能夠組裝成對稱性的直徑為12nm球形結構，并且在溫度達到70℃和pH4～11的范圍內保持結果完整性[4].正因為蛋白納米籠上述的特殊結構及理化特性，近年來在蛋白納米籠腫瘤成像和藥物轉運方面取得了重要進展.在腫瘤靶向方面，美國蒙大拿州立大學的TrevorDouglas課題組分別將短肽RGD4C(CDCRGDCFC)，SP94(SFSIIHTPILPL)引入HSP蛋白C-末端生成融合蛋白，組裝成的蛋白納米籠具有靶向識別黑色素瘤細胞及肝癌細胞的特性;在腫瘤成像及診斷方面，TrevorDouglas課題組通過基因突變在HSP蛋白引入半胱氨酸，利用半胱氨酸巰基與馬來酰亞胺功能化的熒光素縮合得到了熒光素標記的納米籠[5].因此，開發具有新型功能的HSP蛋白納米籠具有重要意義.
本研究在HSP序列的C末端引入聚精氨酸九肽，制備融合陽離子肽的HSP蛋白納米籠用于核酸類藥物的輸送，探索開發基于蛋白納米籠的siRNA高效轉運體系，對開發設計智能、安全和高效的核酸類藥物載藥體系具有重要意義.
本研究成功構建了小熱休克蛋白與聚精氨酸九肽(HSP-R9)融合蛋白的原核表達載體，并對HSP-R9的原核表達條件進行優化(IPTG濃度為0.5mmol、37℃誘導4h)，通過親和層析方法對HSP-R9蛋白進行了純化，得到了高純度的HSP-R9蛋白，為下一步研究HSP-R9蛋白納米籠的功能奠定了基礎.
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