發布時間：2020-02-27所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： [摘要]目的：建立黃柏藥材中總生物堿的含量測定方法。方法：采用酸性染料比色法，通過對pH值，顯色劑用量，測定波長等實驗條件進行篩選，尋求最佳測定條件。結果：在pH=5.2，0.03%酸性染料3mL，測定波長為415nm時，能準確測定黃柏藥材中總生物堿的含量，其精
[摘要]目的：建立黃柏藥材中總生物堿的含量測定方法。方法：采用酸性染料比色法，通過對pH值，顯色劑用量，測定波長等實驗條件進行篩選，尋求最佳測定條件。結果：在pH=5.2，0.03%酸性染料3mL，測定波長為415nm時，能準確測定黃柏藥材中總生物堿的含量，其精密度、線性、重復性、回收率等均良好。結論：本含量測定方法操作方便，重現性好，準確性好，可以用于黃柏總生物堿的含量的測定。
[關鍵詞]黃柏;生物堿;鹽酸小檗堿;酸性染料比色法
1前言
黃柏為黃皮樹(蕓香科植物)的干燥樹皮，其具有瀉火除蒸，除骨蒸清虛熱，解毒療瘡的藥理作用[1]，黃柏藥材含有多種生物堿，其中包括小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿等多種生物堿[2]，中華人民共和國藥典只對小檗堿和黃柏堿進行了含量要求。本文采用酸性染料比色法對其總生物堿含量進行了測定，結果準確，重現性較好。
2儀器與試劑
2.1儀器
紫外分光光度儀(WARIANCary50)，電子分析天平(奧豪斯AX224ZH/E)，超聲波清洗器(型號SK8210LHC上海科導超聲儀器有限公司)，高效液相色譜儀(FL2200福立儀器)。
2.2試藥
黃柏(購于湖南、四川、江西等省)，鹽酸小檗堿(含量>98%，四川玉鑫藥業有限公司)，溴麝香草酚藍(天津永大化學試劑有限公司)，枸櫞酸、磷酸氫二鈉、甲醇、醋酸、氯仿等均為分析純。
3方法與結果
3.1試劑的制備
3.1.1對照品的制備精密稱取鹽酸小檗堿6.90mg，置50mL的量瓶中，加pH=5.2枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液溶解至刻度，搖勻，即得(138.9μg/mL)。
3.1.2供試品的制備[3]
取黃柏粗粉約5g，精密稱定。加100mL醋酸-甲醇(1∶100)，50℃超聲30min，濾過，濾渣同法再超聲提取一次。合并濾液，至250mL量瓶中，加醋酸甲醇(1∶100)至刻度，搖勻，精密量取上述溶液4.0mL，置25mL量瓶中，加醋酸甲醇(1∶100)至刻度，搖勻，得供試品溶液。
3.1.3枸櫞酸-磷酸二氫鈉緩沖液的配制
pH為4.4，4.8，5.2，5.6，6.0緩沖溶液每100mL的配比如表1：
3.1.4酸性染料的配制
精密稱取溴麝香草酚藍0.05058g，溶于pH=5.2枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中并定容至100mL。
3.2酸性染料比色法條件的選擇
3.2.1緩沖溶液pH的確定
精密量取3.1.1對照品溶液1mL共5份，各分別加入pH=4.4，4.8，5.2，5.6，6.0的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液8mL，再加入pH=4.4，4.8，5.2，5.6，6.0的溴麝香草酚藍溶液3mL、氯仿4mL，振搖，靜止30min后分出下層，再加入氯仿4mL同法萃取2次，合并氯仿萃取液，氯仿定容至25mL，加入0.5g無水硫酸鈉脫水。在波長415nm處測定其吸光度[5]。實驗表明對照品在pH=5.2時有最大吸收，結果見圖1，故實驗中選用pH=5.2緩沖液。
3.2.2酸性染料用量的選擇
取乙醇配制的濃度為142μg/mL的鹽酸小檗堿對照品1mL共6份，水浴揮干甲醇，分別加入pH=5.2緩沖液配制的溴麝香草酚藍溶液1.5，2，2.5，3，3.5，4mL、同3.2.1中的萃取方法及測定方法進行測定。結果表明當溴麝香草酚藍溶液加入量大于3.0mL時，吸收趨于穩定，結果見圖2，所以溴麝香草酚藍溶液的加入量為3mL。
3.2.3測定波長的選擇
分別精密吸取3.1.1鹽酸小檗堿對照品溶液1mL和3.1.2供試品溶液1mL，各加pH=5.2緩沖液8.0mL、溴麝香草酚藍溶液3.0mL、氯仿4mL，振搖，靜置30min后分出下層，反復萃取3次，合并氯仿萃取液，移入25mL量瓶中加氯仿至刻度，加入0.5g無水硫酸鈉脫水[6]，在波長200~800nm處測定吸光度。結果表明，對照品溶液和供試品溶液在波長415nm處均有穩定的最大吸收，結果如圖3所示，故選擇415nm為測定波長。
3.3標準曲線
分別精密量取對照品濃度55.2μg/mL、82.8μg/mL、110.4μg/mL、138.0μg/mL、165.6μg/mL的對照品1.0mL，按照3.2.3方法在波長415nm處測定其吸光度，可得回歸方程y=0.0023x+0.0604，R2=0.9996，表明鹽酸小檗堿濃度在40~200μg/mL之間有良好的線性關系。
3.4精密度實驗
取3.1.1對照品溶液，按照3.2.3方法操作得到萃取液，搖勻，連續5次在波長415nm處測定其吸收，結果如表2。由表2可知，RSD為0.71%，n=5。儀器精密度良好。
3.5穩定性試驗
精密吸取3.1.2供試品溶液1.0mL，按照3.2.3方法操作得到萃取液，搖勻，在不同時間間隔里在波長415nm處測定其吸收，結果RSD為0.99%，n=5。表明供試品溶液在5小時內基本穩定。
3.6重復性實驗
分別精密量取1.0mL的3.1.2供試品溶液共5份，編號為1、2、3、4、5，分別按照3.2.3方法操作得到萃取液，分別在波長415nm處測定其吸收，結果RSD為1.09%(n=5)。表明供試品溶液重復性良好。
3.7回收率實驗
精密稱量藥材5份粗粉約5.0g，加100mL醋酸甲醇(1∶100)，50℃超聲處理30min，抽濾得濾液及殘渣。用適量醋酸甲醇(1∶100)沖洗殘渣和濾紙，二次超聲提取殘渣，加100mL醋酸甲醇(1∶100)，50℃超聲處理30min，抽濾得濾液，與一次濾液合并，移入250mL容量瓶中加醋酸甲醇(1∶100)至刻度，得到黃柏提取液。精密吸取提取液2.0mL和1.72mg/mL的對照品溶液1mL混合，移入25mL容量瓶中加醋酸甲醇(1∶100)定容至刻度，得分別在波長415nm處測定其吸收，計算回收率，結果如下表2。由表2可知，樣品的回收率平均達到96.9%，RSD為2.18%，n=5。
3.8樣品的測定
所購樣品按3.1.2供試品制備方法進行制備，按照3.2.3方法操作得到萃取液，在波長415nm處測定其吸光度，結果所購三個樣品含量依次為4.83%，5.29%，5.16%。
4結論與討論
(1)酸性染料比色法測定黃柏中總生物堿的含量的測定方法，精密度實驗RSD為0.71%(n=5)，穩定性實驗RSD為0.99%(n=5)。重復性實驗RSD為1.09%(n=5)，回收率96.9%(n=5)。此操作方便，重現性好，準確性好，可以用于黃柏總生物堿的含量的測定。
(2)按照中國藥典的方法對三批藥材中鹽酸小檗堿的含量進行測定，得樣品中鹽酸小檗堿的含量依次為3.68%，4.18%，4.02%。分別占有總生物堿的76.2%，79.0%，77.9%。由此可見，雖然黃柏中還有其他的生物堿，比如黃柏堿、藥根堿、蝙蝠葛任堿、木蘭花堿等，但均以鹽酸小檗堿為主，并且含量占比相對穩定。
(3)采用柱色譜法對三批藥材也進行了總生物堿的含量測定[7]，得到樣品中總生物堿的含量依次為4.32%、4.82%、4.66%，均低于酸性染料比色法。主要可能是此法只對季銨型總生物堿進行了測定，而酸性染料比色法能對多種生物堿都能進行測定。
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