發(fā)布時間：2020-02-13所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:為了解聚乙烯亞胺(PEI)基因載體材料對生物體的細胞毒性機理，采用動態(tài)光散射、紫外可見光吸收光譜、熒光光譜和圓二色譜研究PEI(分子量為25kDa)對二油酰基磷脂酰絲氨酸(DOPS)脂質(zhì)體與溶菌酶相互作用的影響。實驗發(fā)現(xiàn):PEI對溶菌酶的構(gòu)象影響不明顯，但是P
摘要:為了解聚乙烯亞胺(PEI)基因載體材料對生物體的細胞毒性機理，采用動態(tài)光散射、紫外—可見光吸收光譜、熒光光譜和圓二色譜研究PEI(分子量為25kDa)對二油酰基磷脂酰絲氨酸(DOPS)脂質(zhì)體與溶菌酶相互作用的影響。實驗發(fā)現(xiàn):PEI對溶菌酶的構(gòu)象影響不明顯，但是PEI與DOPS的靜電結(jié)合能引起脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的變化并對脂質(zhì)體與溶菌酶的相互作用產(chǎn)生影響。在水溶液中，溶菌酶與DOPS脂質(zhì)體結(jié)合，部分嵌入脂質(zhì)體雙分子層的疏水區(qū)，導致溶菌酶α-螺旋結(jié)構(gòu)的減少，PEI與DOPS脂質(zhì)體的結(jié)合增強了脂質(zhì)體膜內(nèi)疏水性及其與溶菌酶的相互作用。
關(guān)鍵詞:聚乙烯亞胺;磷脂酰絲氨酸;脂質(zhì)體;相互作用
基因治療是當前生物醫(yī)學領(lǐng)域的前沿研究，為惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及遺傳疾病的治療提供了新方法，該技術(shù)的關(guān)鍵是需要建立高效低毒的基因載體。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)作為典型的陽離子聚合物，由于其高電荷密度和強大的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”而擁有良好的基因轉(zhuǎn)染效率，分子量為25kDa的支鏈PEI(bPEI25k)被認為是聚合物基因載體的“黃金標準”[1]。PEI具有不同程度的細胞毒性，但是目前人們對其細胞毒性機理的了解還相當有限[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，PEI的毒性與其對細胞膜的擾動有關(guān)[4-7]。細胞膜主要由脂類、蛋白質(zhì)、糖類等組成，而蛋白質(zhì)與物質(zhì)傳遞、能量轉(zhuǎn)換及細胞識別等功能密切相關(guān)。生物體內(nèi)廣泛存在生物膜與蛋白質(zhì)的相互作用，蛋白質(zhì)與生物膜中的磷脂以疏水和靜電相互作用，不僅改變自身的空間構(gòu)象如去折疊或造成蛋白質(zhì)聚集等，而且還改變磷脂膜的分布與排列進而影響生物膜的功能與結(jié)構(gòu)[8-9]。
溶菌酶(Lysozyme，Lys)在體內(nèi)廣泛存在，通過水解肽聚糖的糖苷鍵破壞各種致密的微生物膜結(jié)構(gòu)，具有很強的抗菌消炎作用[10]。Lys的抗菌作用與Lys和細菌膜脂質(zhì)相互作用有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)Lys能分別滲透到大腸桿菌的外膜和內(nèi)膜，同時能使細胞質(zhì)膜去極化而引起細胞質(zhì)滲漏[11]。Tsunoda等[12]、Kinnunen等[13]和Gorbenko等[14]認為Lys以靜電作用吸附在負電磷脂膜如磷脂酰甘油(phatidylglycerol，PG)、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)磷脂膜表面，并通過疏水作用部分插入磷脂膜雙分子層，從而使磷脂膜的結(jié)構(gòu)和Lys的構(gòu)象發(fā)生變化。
為研究PEI對蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體相互作用可能造成的影響，筆者選用二油酰基磷脂酰絲氨酸(dioleoylphosphatidylserine，DOPS)制備脂質(zhì)體來模擬細胞膜，采用動態(tài)光散射、紫外—可見光吸收光譜、熒光光譜和圓二色譜研究PEI25k對DOPS-Lys的相互作用及其對Lys構(gòu)象的影響。
1實驗部分
1.1材料和試劑
DOPS購自于德國Lipoid;Lys、支化PEI25k均購自于美國Sigma;實驗中所有溶劑為色譜純，來自西隴化工;實驗中PBS緩沖液濃度為10mmol，pH7.4。所有的材料均未經(jīng)過進一步的純化。PEI和Lys溶解于10mmol磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)，分別配制5mg/mL、400μmol的儲液，以HCl/NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，0～5℃保存?zhèn)溆茫褂脮r以PBS稀釋至所需要的濃度。
1.2實驗過程及儀器
1.2.1脂質(zhì)體的制備
準確稱取一定量的DOPS溶于6mL氯仿—甲醇混合溶劑(體積比為2∶1)，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，氮氣沖刷磷脂膜30s，真空干燥過夜，加入5mLPBS進行水化，超聲波分散2h后用美國默格LiposoEasyLE-1型脂質(zhì)體擠出器擠壓碳酸酯膜21次，所得大單層脂質(zhì)體(LUV)用PBS稀釋至100mL，Stewart法[15]測定磷脂含量，0～5℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2動態(tài)光散色
準確移取PEI儲液、Lys儲液、DOPS脂質(zhì)體儲液和PBS過濾液，配制PEI濃度系列變化的PEI-DOPS和PEI-Lys-DOPS分散液(Lys最終濃度為5μmol，DOPS終濃度為250μmol)，使用馬爾文ZetasizerNanoZS型粒徑電位儀測樣品的粒徑。
1.2.3紫外吸收光譜法
配制PEI濃度系列變化的PEI-Lys溶液和PEI-Lys-DOPS分散液，以相同濃度的PEI溶液作為參比，使用UV-2501PC分光光度計(日本島津Shimadzu)測定Lys的紫外吸收光譜，波長掃描范圍為200～600nm。
1.2.4熒光光譜法
配制PEI濃度系列變化的PEI-Lys溶液和PEI-Lys-DOPS分散液，用RF-6000熒光分光光度計(日本島津Shimadzu)測定Lys發(fā)射熒光光譜(λex=295nm)和同步熒光光譜(Δλ=15nm)，波長掃描范圍為250～450nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5.0nm。實驗時以相同濃度的PEI溶液和PEI-DOPS溶液作為背景，并從最終結(jié)果中扣除。
1.2.5圓二色譜
配制PEI濃度系列變化的PEI-Lys溶液和PEI-Lys-DOPS分散液，使用光程為2mm的石英比色皿，在ChirascanSpectrometer型CD光譜儀(英國AppliedPhotophysicsLtd公司)室溫下測定Lys圓二色譜，波長掃描范圍為190～260nm，采樣間隔為0.5nm，響應(yīng)時間為0.5s。同樣實驗條件下測定相同濃度的PEI溶液及PEI-DOPS溶液的圓二色譜，其影響在最終結(jié)果中扣除。
2結(jié)果與討論
2.1PEI對Lys-DOPS脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響
粒徑是反映脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要參數(shù)，為了解PEI對Lys-DOPS脂質(zhì)體穩(wěn)定性的可能影響，分析了DOPS脂質(zhì)體在含Lys和PEI溶液中流體動力學直徑的變化，結(jié)果見圖1。制備的DOPS脂質(zhì)體在PBS中的流體動力學直徑約為78.3nm，添加少量PEI導致脂質(zhì)體流體動力學直徑急劇增大，在cPEI25k=0.01mg/mL附近達到最大值后迅速減小，cPEI25k>0.1mg/mL時，脂質(zhì)體流體動力學直徑基本不變并與無PEI溶液中結(jié)果相仿。這一結(jié)果與Yasuhara等[16]的研究相吻合，Yasuhara認為PEI在DOPS脂質(zhì)體表面的靜電結(jié)合引起脂質(zhì)體表面電位的變化，少量PEI引起脂質(zhì)體產(chǎn)生膜融合，高濃度的PEI導致脂質(zhì)體表面電位發(fā)生反轉(zhuǎn)而阻礙膜融合的產(chǎn)生。
圖1同時顯示，PEI-Lys-DOPS脂質(zhì)體分散液脂質(zhì)體粒徑也有相似的變化規(guī)律，不同的是Lys的存在使得脂質(zhì)體粒徑變化更為顯著，表明Lys與脂質(zhì)體結(jié)合并導致脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。研究顯示，Lys通過靜電作用結(jié)合在DPPG脂質(zhì)體表面，蛋白質(zhì)部分插入磷脂雙分子層。Gorbenko等[13-14]的研究顯示Lys與PG、PS磷脂膜的靜電相互作用導致Lys及磷脂膜結(jié)構(gòu)的變化，Lys部分嵌入磷脂雙分子膜疏水碳氫區(qū)域。
2.2吸收光譜
紫外—可見光吸收是分析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的常用方法，為了了解PEI25k對DOPS脂質(zhì)體-Lys相互作用的可能影響，測定了PEI濃度系列變化的DOPS脂質(zhì)體-Lys-PEI25k溶液的吸收光譜，考慮到PEI25k對Lys構(gòu)象的影響，同時測定了Lys-PEI25k溶液的吸收光譜，結(jié)果見圖2。在PBS中，Lys分別在216nm和281nm出現(xiàn)一個強的吸收峰，分別有蛋白質(zhì)骨架肽鍵n→σ*躍遷和芳香族氨基酸殘基的π→π*躍遷產(chǎn)生[17]。由圖2可見，Lys-PEI溶液中Lys在216nm處的吸收峰隨PEI的濃度增加而增強，并伴有輕微的紅移，表明PEI與Lys作用形成了復合物并可能導致Lys二級結(jié)構(gòu)的變化[17]。PEI25k與DOPS的相互作用使Lys骨架肽鍵吸收強度下降，最大吸收波長紅移，然而隨著PEI濃度的增大，Lys在216nm處吸光度急劇增大，最大吸收波長明顯紅移，說明DOPS增強了PEI與Lys的相互作用。
2.3熒光光譜分析
熒光光譜被廣泛應(yīng)用來研究蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化。蛋白質(zhì)的主要熒光由色氨酸殘基和酪氨酸殘基貢獻，兩者的熒光光譜發(fā)生相互疊加，采用295nm激發(fā)波長避免酪氨酸殘基與色氨酸殘基之間的共振能量轉(zhuǎn)移，由于蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化對后者發(fā)射熒光的影響，同時利用同步熒光光譜法(Δλ=15nm)獲得酪氨酸殘基的熒光特征，結(jié)果分別見圖3和圖4。
色氨酸對所處微區(qū)環(huán)境的變化很敏感，峰位發(fā)生紅移說明其所處微區(qū)環(huán)境疏水性減弱或極性增強[18]。Lys具有多個色氨酸殘基，分布在蛋白質(zhì)表面和疏水內(nèi)核[19]，因此由圖3可見，Lys色氨酸殘基最大熒光發(fā)射波長出現(xiàn)在338nm附近[19]。隨著溶液中PEI濃度的增加，Lys色氨酸熒光發(fā)射波長沒有發(fā)生明顯變化，說明其所處微區(qū)極性沒有發(fā)生變化，但是可能由于與PEI結(jié)合減少了水分子碰撞引起的動態(tài)猝滅，其熒光強度略有增加。DOPS脂質(zhì)體的存在使得Lys色氨酸熒光強度增加，最大發(fā)射波長蘭移，說明色氨酸殘基所處微區(qū)環(huán)境極性下降，Lys分子可能嵌入DOPS脂質(zhì)體雙分子層，這一結(jié)果與Tsunoda[12]和Kinnunen[13]的研究相一致。PEI-Lys-DOPS脂質(zhì)體分散液中Lys色氨酸熒光強度進一步增加，最大發(fā)射波長蘭移更加明顯，說明PEI與DOPS的結(jié)合造成脂質(zhì)體膜內(nèi)環(huán)境的疏水性增加。
與色氨酸殘基相比，酪氨酸殘基的熒光對溶劑極性的變化不敏感。由圖4可以看到，隨著溶液中PEI濃度的增加，Lys酪氨酸殘基最大熒光發(fā)射波長基本保持不變，但是其熒光強度略有增加。DOPS的存在使Lys酪氨酸殘基的熒光變化更為明顯，這一規(guī)律與色氨酸殘基熒光相類似，說明酪氨酸殘基熒光的變化不是由于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化引起的酪氨酸殘基與色氨酸殘基之間共振能量轉(zhuǎn)移的變化造成的，而應(yīng)該歸因于與PEI和DOPS脂質(zhì)體相互作用減少了溶劑分子的碰撞猝滅。
2.4圓二色譜
圓二色光譜是分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的常用工具，在遠紫外區(qū)(190～260nm)的圓二色光譜與蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊含量有關(guān)[20]。本文測定了Lys-PEI溶液體系和Lys-PEI-DOPS溶液體系中的遠紫外CD光譜，結(jié)果見圖5。Lys在208nm和222nm處出現(xiàn)兩個顯著的負峰，這是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰[21]。實驗發(fā)現(xiàn)，PEI對Lys二級結(jié)構(gòu)的影響很小，但是DOPS脂質(zhì)體使得Lys在208nm和222nm圓二色橢圓度負值略有減小，溶液中添加PEI使得這一規(guī)律更加明顯，說明PEI增強了DOPS與Lys的相互作用，并導致Lys的α-螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)減少。
3結(jié)論
PEI分子具有大量的氨基基團，易于與Lys和DOPS脂質(zhì)體結(jié)合形成復合物。PEI與Lys的結(jié)合對Lys的構(gòu)象影響不明顯，但是PEI與DOPS的靜電結(jié)合能引起脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的變化并對脂質(zhì)體與Lys的相互作用產(chǎn)生影響。在水溶液中，Lys與DOPS脂質(zhì)體結(jié)合，部分嵌入脂質(zhì)體雙分子層的疏水區(qū)，導致溶菌酶α-螺旋結(jié)構(gòu)的減少，PEI與DOPS脂質(zhì)體的結(jié)合增強了脂質(zhì)體膜內(nèi)疏水性及其與Lys的相互作用。
相關(guān)期刊推薦：《廣西大學學報(自然科學版)》(雙月刊)創(chuàng)刊于1976年，是廣西大學主管、主辦的綜合性學術(shù)理論期刊。主要刊登有關(guān)數(shù)學、物理、化學、計算機科學、機械、電氣、土木、化工、輕工、礦冶等理工科各專業(yè)有關(guān)基礎(chǔ)科學和應(yīng)用科學的科研論文和綜述評論等。內(nèi)容以綜合性和學術(shù)性為特點。讀者對象為科技工作者和大專院校理工科師生。
