發(fā)布時(shí)間：2020-06-09所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：脂質(zhì)不僅是細(xì)胞膜的主要組成部分，還參與一些生命活動(dòng)如能量存儲(chǔ)、信號(hào)傳導(dǎo)等，在生命體中發(fā)揮著重要作用。近年來，越來越多的研究表明脂質(zhì)的變化與一些重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，脂質(zhì)組學(xué)研究對(duì)理解疾病的發(fā)生機(jī)制及過程具有重要意義。在脂質(zhì)分析
摘要：脂質(zhì)不僅是細(xì)胞膜的主要組成部分，還參與一些生命活動(dòng)如能量存儲(chǔ)、信號(hào)傳導(dǎo)等，在生命體中發(fā)揮著重要作用。近年來，越來越多的研究表明脂質(zhì)的變化與一些重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，脂質(zhì)組學(xué)研究對(duì)理解疾病的發(fā)生機(jī)制及過程具有重要意義。在脂質(zhì)分析過程中，由于樣品基質(zhì)的干擾或被分析物濃度的限制，通常需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，以得到最佳的分析性能。該文綜述了脂質(zhì)組學(xué)分析中的樣品前處理技術(shù)，包括脂質(zhì)的提取方法(如液液萃取、固相萃取等)和針對(duì)不同類脂質(zhì)的化學(xué)衍生化技術(shù)在各領(lǐng)域，尤其是生命分析和代謝組學(xué)中的應(yīng)用，并對(duì)脂質(zhì)組學(xué)分析中的樣品前處理技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了展望。
關(guān)鍵詞：脂質(zhì)組學(xué);樣品前處理;脂質(zhì)提取;化學(xué)衍生化;綜述
作為代謝物的一大類重要組成部分，脂質(zhì)在生命體中扮演著重要作用，如磷脂雙分子層是構(gòu)成細(xì)胞膜的基本骨架，可維持細(xì)胞的完整性和相對(duì)獨(dú)立性;脂肪酸和甘油三酯是多種細(xì)胞的能量來源，維持細(xì)胞的基本活動(dòng)與功能;許多脂質(zhì)分子如類花生酸、溶血磷脂、內(nèi)源性大麻素等可作為二級(jí)信號(hào)傳遞分子，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等。脂質(zhì)組學(xué)(lipidomics)作為代謝組學(xué)(metabolomics)的一個(gè)重要分支，是對(duì)脂質(zhì)及其相關(guān)結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究的科學(xué)，其定義為“對(duì)脂質(zhì)分子種屬及其在生物學(xué)上的作用，涵蓋脂類代謝、功能蛋白質(zhì)表達(dá)以及基因調(diào)控等因素的全面描述”[1]。根據(jù)脂質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，可將其分為8大類[2]：脂肪酰類(fattyacyls，F(xiàn)A)、甘油酯類(glycerolipids，GL)、甘油磷脂類(glycero-phospholipids，GP)、鞘脂類(sphingolipids，SP)、固醇類(sterollipids，ST)、異戊烯醇類(prenollip-ids，PL)、糖脂類(saccharolipids，SL)和聚酮類(polyketides，PK)等。每一類型的脂質(zhì)由于極性頭基、碳鏈長度或不飽和度的差異又可形成不同的結(jié)構(gòu)，由此組成種類繁多、性質(zhì)各異的脂質(zhì)分子。越來越多的研究表明，脂質(zhì)的合成或代謝異常與多種疾病密切相關(guān)，如癌癥[3]、阿茲海默癥[4]、動(dòng)脈粥樣硬化[5]等。脂質(zhì)組學(xué)研究已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，面對(duì)復(fù)雜的脂質(zhì)組分，發(fā)展準(zhǔn)確、靈敏、可靠的脂質(zhì)組學(xué)分析方法顯得尤為重要。
相關(guān)期刊推薦：《色譜》Chinese Journal of Chromatography(月刊)1984年創(chuàng)刊，是專業(yè)性學(xué)術(shù)期刊，主要報(bào)道色譜學(xué)科的基礎(chǔ)性研究成果、色譜及其交叉學(xué)科的重要應(yīng)用成果及其進(jìn)展，包括新方法、新技術(shù)、新儀器在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，以及色譜儀器與部件的研制和開發(fā)。適于科研院所等從事色譜基礎(chǔ)和應(yīng)用技術(shù)研究的科研人員、色譜及其相關(guān)學(xué)科的碩士及博士研究生、分析測試領(lǐng)域的基層科研人員、色譜儀器開發(fā)及經(jīng)營單位的有關(guān)人員閱讀。
目前，質(zhì)譜(MS)已成為脂質(zhì)組學(xué)研究中最有效的技術(shù)手段之一�；贛S的分析方法主要可分為3種：利用MS直接進(jìn)樣檢測的“鳥槍法”，與其他分離技術(shù)如液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、毛細(xì)管電泳(CE)等結(jié)合的聯(lián)用方法，以及可實(shí)現(xiàn)樣品空間分布的質(zhì)譜成像(MSI)方法。脂質(zhì)組學(xué)研究對(duì)象通常是基質(zhì)復(fù)雜的生物樣品，如血清、血漿、尿液、組織等，除MSI方法外，在進(jìn)行分析前往往需要對(duì)樣品進(jìn)行富集和提取。提取后的脂質(zhì)在MS檢測時(shí)可能仍會(huì)面臨靈敏度低等問題，這就需要對(duì)樣品做進(jìn)一步處理，化學(xué)衍生化是解決該類問題的有效手段之一。本文針對(duì)脂質(zhì)組學(xué)分析中的樣品前處理技術(shù)，以脂質(zhì)化合物提取方法與衍生化技術(shù)為重點(diǎn)進(jìn)行了評(píng)述，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。
1脂質(zhì)的提取與富集技術(shù)
通常生物樣本采集后直接利用液氮快速冷凍，之后放入低溫(如-80℃)環(huán)境儲(chǔ)存，從而盡量減少樣品中各類物質(zhì)發(fā)生改變[6]。在進(jìn)行分析前，液體樣品在4℃條件下復(fù)溶，然后進(jìn)行充分混合;固體樣品則可借助研缽或勻漿機(jī)，通過加入適當(dāng)溶劑完成混合[7]。
常用的脂質(zhì)提取技術(shù)主要包括液液萃取(LLE)與固相萃取(SPE)兩種方式。由于LLE可提取出較為全面的脂質(zhì)分子，適用于非靶向全脂分析;SPE過程使樣品經(jīng)過分離和富集步驟，進(jìn)一步除去干擾物質(zhì)，提高被分析物的濃度，更適用于某一類或某幾類脂質(zhì)分子的靶向代謝組學(xué)分析。
1.1液液萃取
生物樣品中蛋白質(zhì)的存在會(huì)影響脂質(zhì)分析方法的精確度與準(zhǔn)確性，如不提前去除，可能縮短儀器的使用壽命[8]。為了減少樣品損失，前處理步驟應(yīng)盡可能少，相對(duì)簡單的操作是將蛋白質(zhì)沉淀與脂質(zhì)提取一步完成。Zhao等[9]提出一種向血樣(血清或血漿)中加入過量甲醇的簡單提取方法，用來分析人血中的磷脂和溶血磷脂。t’Kindt等[10]用同樣的方法提取了人皮膚中的神經(jīng)酰胺，其中一部分利用電噴霧電離-質(zhì)譜(ESI-MS)的負(fù)離子模式進(jìn)行分析，而另一部分提取液經(jīng)SPE提取后在正離子模式條件下進(jìn)行分析，兩部分結(jié)果總計(jì)鑒定到264種神經(jīng)酰胺分子。
由于復(fù)雜的脂質(zhì)分子間極性存在巨大差異，一種溶劑的提取方法已不能滿足全脂分析的需求，混合溶劑的單相提取方法得到了發(fā)展。Pellegrino等[11]開發(fā)了一種全脂分析方法，他們向50μL血清中加入1mL甲醇-甲基叔丁基醚(MTBE)-氯仿(1.33∶1∶1，v/v/v)混合溶液(MMC)，經(jīng)過渦旋、離心后用LC-MS進(jìn)行分析。結(jié)果表明，血清中9種脂質(zhì)的回收率接近100%。Calderón等[12]在Sarafian等[13]工作的基礎(chǔ)上，以宮頸癌Hela細(xì)胞為分析對(duì)象，比較了兩種單相異丙醇-水混合體系(75∶25，v/v和90∶10，v/v)與傳統(tǒng)兩相萃取體系(Bligh-Dyer法[14]和Matyash法[15])的性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異丙醇-水(90∶10，v/v)的萃取效果與Matyash法相當(dāng)，并且優(yōu)于另兩種方法。除此之外，研究人員報(bào)道了多種單相萃取體系用于脂質(zhì)組學(xué)分析，如氯仿-甲醇(2∶1，v/v)[16]、正丁醇-甲醇(1∶1，v/v)[17]體系等。Jurowski等[18]就用于脂質(zhì)組學(xué)分析的單相混合溶劑進(jìn)行了綜述。
LLE是脂質(zhì)組學(xué)中使用最廣泛的萃取方法。與單相溶劑萃取體系不同，LLE利用被分析物在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的差異實(shí)現(xiàn)不同物質(zhì)的分離。脂質(zhì)組學(xué)分析中應(yīng)用最多的LLE方法有3種：Folch法[19]、Bligh-Dyer法和Matyash法。其中Folch法使用氯仿-甲醇-水(8∶4∶3，v/v/v)混合溶劑對(duì)生物樣品進(jìn)行全脂提取，Bligh-Dyer法在上述方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，使用相同溶劑體系但不同體積比(2∶2∶1.8)，以此減少溶劑用量，縮短提取時(shí)間，并且還可減少有毒試劑氯仿的使用。氯仿與甲醇的混合體系能在多種復(fù)雜基質(zhì)中非選擇性地提取出各種脂質(zhì)分子，水相的加入可以增強(qiáng)相分離，減小脂質(zhì)在水相中的溶解度，從而提高萃取效率。為了減小溶劑毒性，Carlson[20]用二氯甲烷替代氯仿進(jìn)行血清和組織的脂質(zhì)萃取。然而，上述方法在進(jìn)行脂質(zhì)提取時(shí)，含有脂質(zhì)的有機(jī)相位于兩相溶液的下層，無論是直接移取下層溶液還是去除上層液體，都面臨可能造成溶液污染或樣品損失的問題。
Matyash等[15]使用低密度的MTBE與甲醇和水組成的混合溶液(10∶3∶2.5，v/v/v)作為萃取溶劑對(duì)鼠腦和人血漿進(jìn)行全脂分析，并與Folch法和Bligh-Dyer法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，在4種不同的基質(zhì)中，Matyash法的回收率與其他兩種方法的結(jié)果相當(dāng)甚至更好。使用MTBE代替氯仿，降低了溶劑的毒性和致癌性，并且含脂質(zhì)的有機(jī)相位于兩相溶液的上層，簡化了相分離步驟。Lfgren等[21]提出了另一種基于丁醇和甲醇的無氯仿體系(BUME)，他們向75μL血漿中加入300μL丁醇-甲醇(3∶1，v/v)溶液后，再加入300μL庚烷-乙酸乙酯(3∶1，v/v)溶液和300μL1%(v/v)乙酸水溶液進(jìn)行全脂萃取。整個(gè)萃取過程在96孔板中進(jìn)行，在60min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)96份樣品的提取。該方法分析速度快，自動(dòng)化程度高。
近幾年來，基于LLE方法的脂質(zhì)組學(xué)在多個(gè)領(lǐng)域開展應(yīng)用，所用的萃取體系多是在上述傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。Buyer等[22]在Bligh-Dyer溶劑的基礎(chǔ)上加入了0.25mol/L碳酸氫銨，以萃取分析土壤中的磷脂脂肪酸(PLFA)，這種揮發(fā)性鹽的加入不僅使PLFA的萃取效率提高，也提高了土壤中其他代謝物的提取效率。Sostare等[23]則通過改變Matyash溶劑的體積比(MTBE-甲醇-水的體積比由10∶3∶2.5改為2.6∶2.0∶2.4)提高分析方法的萃取效率和重現(xiàn)性。Ren等[24]利用4種方法提取微藻樣品中的脂質(zhì)時(shí)，在每種方法的兩步提取過程間增加一步純水相提取步驟。結(jié)果表明，增加水相處理步驟后脂質(zhì)萃取效率大大提高，提取的脂質(zhì)中甘油三酯的比例有所提高，這在生物柴油的生產(chǎn)領(lǐng)域非常有用。Ulmer等[25]考慮到上述3種最常用方法的萃取溶劑體積可能會(huì)隨樣品基質(zhì)的不同有所改變，他們以人血漿樣品為研究對(duì)象，對(duì)3種方法所用樣品與萃取溶劑的體積比分別進(jìn)行了優(yōu)化。除此之外，不同方法對(duì)相同樣品萃取效果的比較也有諸多研究報(bào)道[11，12，26，27]。
1.2固相萃取
SPE是利用不同物質(zhì)在固液兩相中相互作用的差異實(shí)現(xiàn)分離的，其具體操作是先使被分析物吸附到固定相上，然后使用不同洗脫能力的溶液(流動(dòng)相)分步洗脫，實(shí)現(xiàn)樣品的分離、純化與富集，SPE常被用于脂質(zhì)的萃取。一般來說，SPE常用于LLE之后，目的是去除萃取液中的干擾物質(zhì)或特異性富集某一類或某幾類脂質(zhì)，以用于靶向脂質(zhì)組學(xué)分析。
Hewelt-Belka等[28]先用Bligh-Dyer法對(duì)母乳進(jìn)行全脂萃取，上層水相含有的極性代謝物通過親水相互作用色譜(HILIC)-MS進(jìn)行分析，另一份樣品用HybridSPE-Phospholipid柱處理，將含有磷脂的洗脫部分與LLE的下層有機(jī)相合并后進(jìn)行RPLC-MS分析。該方法可同時(shí)獲得母乳中高豐度甘油糖脂與低豐度甘油磷脂和鞘脂類的信息，是一種可對(duì)母乳進(jìn)行全脂分析的半定量方法。Flieger等[29]使用Cu2+修飾的硅膠柱用于血漿樣品中磷脂的去除。在探究去除磷脂方法的方面，Warren[30]用硅膠作為固定相，氯仿、丙酮、甲醇依次進(jìn)行洗脫，驗(yàn)證甲醇洗脫液中是否只含有磷脂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇洗脫下來的部分除含磷脂外，還有多種其他極性脂質(zhì)。目前已有多種商用化SPE固定相用于脂質(zhì)組學(xué)分析，常用的為硅膠基底，如C8柱或C18柱以及非鍵合或鍵合了氨基、氰基、二羥基或氨丙基的硅膠柱等[31]。硅膠柱和氨丙基柱常被用于分離中等極性和極性脂質(zhì)，而C8柱和C18柱則被用于從水相樣品的極性物質(zhì)中分離腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂和脂肪酸等物質(zhì)[31]。
相對(duì)于SPE，固相微萃取(SPME)使用溶劑量少，分析速度快。SPME常使用一根帶有涂層的纖維用于萃取分析物，基于靜電作用、離子交換作用、疏水相互作用等作用力，目前使用較多的涂層有聚丙烯腈(PAN)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚苯胺(PANI)等[32]。Garwolińska等[33]將一根表面修飾PAN-C18的纖維用甲醇-水(1∶1，v/v)混合溶劑活化20min后直接插入1mL母乳中，經(jīng)過5min吸附后，再放入100μL異丙醇中進(jìn)行洗脫，5min后取出該纖維，洗脫液直接用于LC-MS分析。該方法分析速度快，操作簡便，適用于母乳的全脂分析，并且該方法通過MS的輪廓分析可以區(qū)分母乳、配方奶粉和牛奶樣品。Deng等[34]則使用一種生物相容性材料作為探針的涂層，開展原位、體內(nèi)和微尺度的脂質(zhì)組學(xué)研究。他們將表面修飾有親水性殼聚糖聚合物的鎢針直接插入斑馬魚、大型溞和單個(gè)真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行萃取，洗脫后用納升電噴霧電離(nanoESI)-MS進(jìn)行檢測。與傳統(tǒng)的鳥槍法相比，該方法檢測到的脂質(zhì)結(jié)果相似，但樣品消耗量少，分析時(shí)間短。
SPME技術(shù)常與GC或GC-MS結(jié)合用于揮發(fā)性物質(zhì)的分析，如頂空-GC(HS-GC)的進(jìn)樣針首先在一定條件下對(duì)固體、液體或氣體樣品進(jìn)行萃取吸附，進(jìn)而在進(jìn)樣口實(shí)現(xiàn)洗脫/解吸附并完成進(jìn)樣。此外，SPME也可與全二維GC(GC×GC)分析結(jié)合，借助高靈敏的質(zhì)譜檢測技術(shù)用于環(huán)境污染物和農(nóng)用化學(xué)品的檢測[35]。目前，SPME結(jié)合GC-MS已成功用于多種樣品中脂肪酸或脂肪酸酯的分析，如水果[36]、牛奶[37]、白酒[38]等。盡管SPE/SPME方法所用小柱或涂層容易達(dá)到飽和，成本較高，但具有樣品和溶劑消耗少、分析速度快、易于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，適用于極少量樣品、大規(guī)模樣品及原位分析。
1.3其他萃取技術(shù)
近年來，除了LLE與SPE方法外，許多其他方法也已用于脂質(zhì)組學(xué)樣品前處理中，如微波輔助提取法(MAE)、超聲輔助提取法(UAE)、超臨界流體提取法(SFE)等。MAE主要利用微波的能量在萃取過程中提高溫度和壓力，從而加快萃取速度，提高萃取效率，并且減少有機(jī)溶劑的用量[39]。由于萃取過程中溫度的升高，MAE可能造成熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的分解。deMorais等[40]在人血漿樣品的脂質(zhì)提取中，比較了5種LLE方法與MAE法。結(jié)果顯示，MAE與Folch法的脂質(zhì)萃取總量相當(dāng)，但用GC檢測到的24種脂肪酸含量前者低于后者，說明MAE適合于定性而非定量分析。Pan等[41]以一種離子液體為溶劑，用MAE與傳統(tǒng)LLE相比較，檢測結(jié)果相近但萃取速度大大提高。這都說明在利用MAE萃取脂質(zhì)時(shí)，需要根據(jù)待測物的性質(zhì)進(jìn)行條件優(yōu)化，以期實(shí)現(xiàn)最佳的萃取效果。
UAE是利用超聲波產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)、擴(kuò)散等效應(yīng)加速兩相間物質(zhì)傳遞，從而實(shí)現(xiàn)萃取的技術(shù)[42]。與MAE不同的是，UAE過程中不會(huì)升溫，有利于熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的分析。此外，UAE可與LLE相結(jié)合，進(jìn)一步提高樣品中被分析物的萃取效率。Liu等[43]分析了超聲對(duì)人血清樣品的萃取及衍生過程的影響，結(jié)果表明，萃取及衍生過程均在超聲條件下進(jìn)行時(shí)，測得的脂肪酸信號(hào)增加了5%～60%。
超臨界流體是指溫度與壓力均處于臨界值以上的流體，具有低密度與高擴(kuò)散性的特點(diǎn)，適合于樣品的萃取或分離。SFE中最常用的超臨界流體是CO2，其臨界壓力(7.4MPa)與溫度(31℃)均較低，并且無毒害，易于去除。超臨界CO2的極性與戊烷相近，適合于疏水性物質(zhì)的萃取。用甲醇、二氯甲烷或水作為添加劑，SFE也可用于極性物質(zhì)的萃取[44]。利用SFE的非破壞性，Deviese等[45]用反應(yīng)曲面法優(yōu)化出SFE的最佳條件，用于考古陶罐表面的脂質(zhì)分析。與傳統(tǒng)LLE相比，萃取效率得到提高，并且兩種萃取方法得到的不飽和與飽和脂肪酸的比值不同。SFE作為一種新型的萃取分離技術(shù)，其萃取效率高，無污染，操作方便，適合于生物、食品、藥物等樣品的分析[46-48]。——論文作者：宋詩瑤，白 玉，劉虎威
