發(fā)布時(shí)間：2020-03-07所屬分類(lèi)：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：釉原蛋白羧基末端肽(C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)作為一種小分子內(nèi)源性短肽，在物種間的序列高度保守，提示其在牙齒發(fā)育過(guò)程中參與重要的生理過(guò)程。有研究表明 AMG-CP 對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞的增
摘要背景：釉原蛋白羧基末端肽(C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)作為一種小分子內(nèi)源性短肽，在物種間的序列高度保守，提示其在牙齒發(fā)育過(guò)程中參與重要的生理過(guò)程。有研究表明 AMG-CP 對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖分化有調(diào)控作用，但是 AMG-CP 對(duì)成釉細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。目的：探究不同質(zhì)量濃度 AMG-CP 對(duì)成釉細(xì)胞系 ALC 細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制。方法：人工合成并通過(guò)液相色譜和質(zhì)譜檢測(cè) AMG-CP 合成情況。使用 xCELLigence RTCA 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)觀察 0，0.5，1，2 mg/L AMG-CP 對(duì) ALC 細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè) 0，1，2 mg/L AMG-CP 對(duì) ALC 細(xì)胞周期的影響。Real-time PCR 檢測(cè) 0，1，2 mg/L AMG-CP 對(duì) ALC 細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白 Cyclin D1、 CDK4、MCM2、MCM5 mRNA 表達(dá)水平的影響。Western blot 檢測(cè) 0，1 mg/L AMG-CP 對(duì) ALC 細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞增殖相關(guān)通路中 p-ERK1/2、total-ERK1/2 表達(dá)水平的影響。利用 MAPK-ERK1/2 通路抑制實(shí)驗(yàn)，在 ERK 阻斷劑 U0126 作用下阻斷 ERK1/2 磷酸化，檢測(cè) AMG-CP 對(duì) ALC 細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果與結(jié)論：①與對(duì)照組比較，AMG-CP 促進(jìn) ALC 細(xì)胞增殖，群體倍增時(shí)間降低，并存在濃度梯度依賴(lài)性; ②與對(duì)照組比較，AMG-CP 具有加速細(xì)胞周期的作用;③與對(duì)照組比較，AMG-CP 可以上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因 Cyclin D1、CDK4、MCM2、MCM5 的表達(dá);④與對(duì)照組比較，AMG-CP 可以上調(diào) p-ERK1/2 表達(dá)，激活 MAPK-ERK1/2 信號(hào)通路;⑤U0126 抑制 MAPK-ERK1/2 通路激活后，AMG-CP 失去對(duì) ALC 細(xì)胞促增殖作用;⑥以上結(jié)果證實(shí) AMG-CP 可以激活 MAPK-ERK1/2 通路，加速細(xì)胞周期，進(jìn)而促進(jìn) ALC 細(xì)胞增殖，提示 AMG-CP 具有促進(jìn)成釉細(xì)胞增殖的潛能。
關(guān)鍵詞：釉原蛋白羧基末端肽;釉原蛋白;成釉細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞周期;MAPK-ERK 信號(hào)通路;牙釉質(zhì)發(fā)育
0 引言 Introduction
釉原蛋白是釉基質(zhì)蛋白的重要成分之一，約占釉基質(zhì)的95%，是牙釉質(zhì)形成、成熟、礦化的主要基質(zhì)[1]。釉原蛋白是由釉原蛋白基因的可變剪接及轉(zhuǎn)錄后修飾形成的一種富含脯氨酸的多肽家族，由于存在可變剪接以及釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中的酶解作用，釉原蛋白及其衍生肽組成了釉基質(zhì)[2-3]。釉原蛋白是極性分子，包含疏水的N-端和親水的 C-端，兩個(gè)末端在物種間高度保守。研究表明釉原蛋白除了在釉質(zhì)基質(zhì)成熟和礦化中所起的直接作用外，釉原蛋白可變剪接體及其蛋白水解產(chǎn)物等成分也被認(rèn)為具有信號(hào)傳導(dǎo)作用[4]。早期研究主要關(guān)注于釉原蛋白的可變剪接體作為信號(hào)分子的特定作用，尤其關(guān)注于其在復(fù)雜的牙骨質(zhì)形成過(guò)程的作用，能夠促進(jìn)牙骨質(zhì)的形成和附著[5]。
基質(zhì)金屬蛋白酶20是在釉質(zhì)發(fā)育特定階段表達(dá)的酶，可以水解釉原蛋白產(chǎn)生C-末端多肽[6-7]。研究表明，釉原蛋白 C-末端的11個(gè)氨基酸組成的多肽，即釉原蛋白羧基末端肽 (C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)是重要的信號(hào)分子區(qū)段，能夠?qū)θ顺裳拦琴|(zhì)細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、MC3T3-E1(小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞)的增殖或分化進(jìn)行調(diào)控[6-9]。AMG-CP對(duì)成釉細(xì)胞的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和通路阻斷實(shí)驗(yàn)，研究 AMG-CP對(duì)成釉細(xì)胞系A(chǔ)LC細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 設(shè)計(jì) 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。
1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 2018年7月至2019年2月在北京大學(xué)口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。
1.3 材料
1.3.1 AMG-CP的合成序列及檢測(cè)報(bào)告 AMG-CP的合成序列為 Ac-STDKTKREEVD-NH2( 相對(duì)分子質(zhì)量為 1 347.64)，委托北京賽百盛生物科技有限公司合成。合成的AMG-CP進(jìn)行了液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)分析。無(wú)菌去離子水溶解多肽凍干粉，按實(shí)驗(yàn)所需濃度稀釋分裝。
1.3.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠成釉細(xì)胞系A(chǔ)LC細(xì)胞(ameloblastlineage cells，ALC)由濱州醫(yī)學(xué)院高玉光教授饋贈(zèng)。
1.3.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó));胰蛋白酶(Gbico，美國(guó));胎牛血清(AWB，烏拉圭);青霉素/鏈霉素(Gbico，美國(guó));BAC試劑盒(康為世紀(jì)，北京);U0126(Selleck，上海);兔源p-ERK1/2單克隆抗體， total-ERK1/2單克隆抗體和兔源GAPDH多克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國(guó));二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 (Thremo，美國(guó));醫(yī)用凈化工作臺(tái)(Thremo，美國(guó));純水系統(tǒng)(Millipore，美國(guó));xCELLigence RTCA細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)(ACEA Biosciences，美國(guó));E-Plate L8電極板 (ACEA Biosciences，美國(guó));Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(Licor，美國(guó));Nanodrop 2000(Thermo Fisher，美國(guó)); QuantStudio® 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(Thremo，美國(guó));熒光倒置顯微鏡(Leica，德國(guó))。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 細(xì)胞系培養(yǎng) 小鼠成釉細(xì)胞系A(chǔ)LC細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、100% 濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞匯合至80%時(shí)傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.4.2 實(shí)時(shí)定量檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線(xiàn) 將ALC細(xì)胞按2×103 / 孔的密度接種于E-Plate L8電極板中，每孔200 μL，第2天加入終質(zhì)量濃度為0，0.5，1，2 mg/L AMG-CP[9]，連續(xù)6 d 用 xCELLigence RTCA 細(xì) 胞 分 析 系 統(tǒng) 實(shí) 時(shí) 定 量 分 析 AMG-CP對(duì)成釉細(xì)胞增殖的影響，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。
1.4.3 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ALC細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，將直徑為15 mm的無(wú)菌圓形玻片加入6孔板內(nèi)，將細(xì)胞以2×105 /孔的密度接種于6孔板內(nèi)(設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，每孔2 mL，孵育24 h;PBS沖洗1次，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h以同步化細(xì)胞至G0期，再換為正常含血清培養(yǎng)基，并按分組加入質(zhì)量濃度為0，1，2 mg/L的 AMG-CP 處 理 細(xì) 胞 12 ， 16 ， 20 h ; 然 后 按 照 BeyoCilckTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行EdU-488標(biāo)記染色，熒光顯微鏡下觀察，每組隨機(jī)選擇3個(gè)視野拍照，采用ImageJ半定量分析增殖細(xì)胞比例。
1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 將細(xì)胞以2×105 /孔接種于6孔板內(nèi)(設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，每孔2 mL，孵育24 h;PBS沖洗1次，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h以同步化細(xì)胞至 G0期，再換為正常含血清培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度為0，1， 2 mg/L的AMG-CP處理細(xì)胞12 h，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min;體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇固定 1 h ; PBS 洗 2 次 ， 用 含 0.1%Triton-X-100 及 50 mg/L RNaseA的PBS處理細(xì)胞30 min;離心，棄去PBS;加入適量PBS(0.5-1.0 mL)重懸細(xì)胞，300目細(xì)胞篩過(guò)濾;加入碘化丙啶染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄細(xì)胞周期變化。
1.4.5 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白 CyclinD1、 CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表達(dá) 將細(xì)胞以2×105 / 孔接種于6孔板內(nèi)(設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，每孔2 mL，孵育24 h;PBS沖洗1次，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h以同步化細(xì)胞至G0期，再換為正常含血清培養(yǎng)基，并加入終質(zhì)量濃度為0，1，2 mg/L的AMG-CP作用4 h;Trizol提取細(xì)胞總 RNA，采用Nanodrop 2000測(cè)量吸光度A260/A280，檢測(cè)RNA 樣本濃度和純度，取2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入 PCR儀中擴(kuò)增。結(jié)果采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析程序分析，計(jì)算目的基因相對(duì)值=2-∆∆Ct。引物序列見(jiàn)表1。
1.4.6 MAPK-ERK1/2通路抑制劑U0126處理后AMG-CP 作用下實(shí)時(shí)定量檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線(xiàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ALC 細(xì)胞，按2×103 /孔的密度接種于E-Plate L8電極板中，每孔 200 μL，孵育24 h，加入50 μmol/L MAPK-ERK1/2通路抑制劑U0126預(yù)處理細(xì)胞1 h，隨后用含1 mg/L AMG-CP的培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，利用xCELLigence RTCA細(xì)胞分析系統(tǒng)檢實(shí)時(shí)定量檢測(cè)ALC細(xì)胞增殖，至抑制組細(xì)胞死亡時(shí)停止檢測(cè)，繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。
1.4.7 MAPK-ERK1/2通路抑制劑U0126處理后AMG-CP 作用下Western blot 檢測(cè)p-ERK1/2、total-ERK1/2的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ALC細(xì)胞，以2×105 /孔接種于6孔板內(nèi)，每孔2 mL，孵育24 h，PBS沖洗1次，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基同步化48 h，更換為正常培養(yǎng)基，并加入50 μmol/L U0126 預(yù)處理細(xì)胞1 h;隨后用含1 mg/L AMG-CP的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞1 h，采用Western blot檢測(cè)p-ERK1/2、total-ERK1/2和 GAPDH的表達(dá)。細(xì)胞用PBS洗3次，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細(xì)胞，收集蛋白樣品，BAC試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過(guò)轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用封閉液在室溫下振蕩孵育1 h，按照1∶1 500濃度依次孵育抗total-ERK1/2 抗體、抗p-ERK1/2抗體，緩沖液洗滌膜3次，室溫孵育熒光二抗，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。
1.5 主要觀察指標(biāo) ①在不同質(zhì)量濃度AMG-CP作用下 ALC細(xì)胞增殖曲線(xiàn)及細(xì)胞倍增時(shí)間;②在不同質(zhì)量濃度 AMG-CP作用下EdU熒光染色半定量分析增殖細(xì)胞比例; ③在不同質(zhì)量濃度AMG-CP作用下不同細(xì)胞周期的ALC細(xì)胞數(shù)百分比;④在不同質(zhì)量濃度AMG-CP作用下細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK2、MCM2、MCM5 mRNA的表達(dá)水平;⑤MAPK-ERK1/2信號(hào)通路阻斷后的ALC細(xì)胞增殖曲線(xiàn);⑥ MAPK-ERK1/2 信號(hào) 通 路 阻 斷 后 ALC 細(xì)胞的 p-ERK1/2、total-ERK1/2表達(dá)水平。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 相同實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖采用Graphpad Prim7 進(jìn)行繪圖，進(jìn)行方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較檢驗(yàn)。計(jì)量資料以x _ ±s表示，P ≤ 0.05為差異有顯著性意義。
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2 結(jié)果 Results
2.1 人工合成AMG-CP鑒定 液相色譜對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行分選得到目的產(chǎn)物。質(zhì)譜分析得到相對(duì)分子質(zhì)量為1 347.64 的目的多肽Ac-STDKTKREEVD-NH2，見(jiàn)表2和圖1，2。
2.2 AMG-CP對(duì)ALC細(xì)胞增殖的影響
2.2.1 AMG-CP作用于ALC細(xì)胞的增殖曲線(xiàn)及細(xì)胞倍增時(shí)間 與對(duì)照組相比，0.5，1，2 mg/L AMG-CP實(shí)驗(yàn)組標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)增大，并且隨著AMG-CP質(zhì)量濃度的增加，標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)增加越明顯。各組之間差異有顯著性意義 (P ≤ 0.05)，見(jiàn)圖3。細(xì)胞增殖倍增時(shí)間呈濃度梯度下降趨勢(shì)，各組差異有顯著性意義(P ≤ 0.05)，然而0.5， 1 mg/L組的細(xì)胞倍增時(shí)間在數(shù)值上接近，其生物學(xué)意義不大，見(jiàn)圖4。
2.2.2 EdU染色檢測(cè)AMG-CP對(duì)ALC細(xì)胞增殖的影響 AMG-CP作用20 h后，隨著AMG-CP的質(zhì)量濃度增加，明亮的綠色熒光逐漸增強(qiáng)，見(jiàn)圖5。12 h及16 h的熒光標(biāo)記結(jié)果類(lèi)似，20 h最為顯著，因此作為結(jié)果展示。使用ImageJ 軟件對(duì)EdU染色結(jié)果做半定量分析，結(jié)果顯示2 mg/L AMG-CP作用12，16，20 h都有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，差異有顯著性意義(P ≤0.05)。1 mg/L AMG-CP作用12， 16 h促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性意義，在作用20 h后與對(duì)照組相比能促進(jìn)細(xì)胞增殖，差異有顯著性意義，見(jiàn)圖6。
2.3 AMG-CP 對(duì)ALC細(xì)胞周期的影響
2.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)處于不同細(xì)胞周期的ALC細(xì)胞百分比 0，1，2 mg/L AMG-CP作用12 h后，處于G1期的細(xì)胞比例降低，且隨質(zhì)量濃度的增加而降低;處于S期的細(xì)胞比例上升，且隨質(zhì)量濃度的增加而增加，與對(duì)照組相比差異有顯著性意義(P ≤ 0.05)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組G1/G2細(xì)胞比例差異無(wú)顯著性意義，見(jiàn)表3，圖7。
2.3.2 AMG-CP作用下ALC細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、 CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表達(dá) 1，2 mg/L AMG-CP 作用4 h后，CyclinD1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組(0 mg/L)有顯著增高，差異有顯著性意義 (P ≤ 0.05)，但1 mg/L與2 mg/L組之間差異無(wú)顯著性意義，見(jiàn)圖8。
2.4 AMG-CP作用下ALC細(xì)胞MAPK-ERK1/2信號(hào)通路中 p-ERK1/2、total-ERK1/2的表達(dá) 1 mg/L AMG-CP激活 ALC細(xì)胞中ERK1/2磷酸化(P ≤ 0.05)，對(duì)total-ERK1/2蛋白沒(méi)有影響，見(jiàn)圖9。
2.5 AMG-CP對(duì)ALC細(xì)胞中p-ERK1/2表達(dá)作用被阻斷劑 U0126阻斷
2.5.1 U0126 阻 斷 細(xì) 胞 MAPK-ERK1/2 信 號(hào) 通 路 后 ， AMG-CP對(duì)ALC細(xì)胞增殖的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果 MAPK抑制劑U0126處理后細(xì)胞增殖受抑制，作用20 h后生長(zhǎng)曲線(xiàn)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，細(xì)胞數(shù)量下降。當(dāng)50 μmol/L U0126抑制劑與 1 mg/L AMG-CP同時(shí)作用時(shí)，細(xì)胞增殖的總體趨勢(shì)是抑制的，在細(xì)胞數(shù)量增加階段，50 μmol/L U0126抑制劑+1 mg/L AMG-CP組與50 μmol/L U0126抑制劑組比較差異無(wú)顯著性意義，在細(xì)胞數(shù)量下降階段，50 μmol/L U0126抑制劑+ 1 mg/L AMG-CP組與50 μmol/L U0126抑制劑組比較差異有顯著性意義(P ≤ 0.05)，見(jiàn)圖10。
2.5.2 U0126 阻 斷 細(xì) 胞 MAPK-ERK1/2 信 號(hào) 通 路 后 ， AMG-CP對(duì)ALC細(xì)胞中p-ERK1/2、total-ERK1/2表達(dá)的影響 通過(guò)ERK抑制劑U0126阻斷MAPK-ERK信號(hào)通路情況下，ALC細(xì)胞磷酸化ERK1/2的表達(dá)難以檢測(cè)出來(lái)，對(duì) total-ERK1/2蛋白沒(méi)有影響，這與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，見(jiàn)圖11。AMG-CP可以通過(guò)激活MAPK-ERK信號(hào)通路，使ERK1/2磷酸化，從而促進(jìn)ALC細(xì)胞增殖。
