發布時間：2020-02-26所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：生活于高原鼠兔的血液系統中外周血紅細胞及骨髓有核紅細胞數目及形態的變化，對其低氧適應有重要意義。 目的：通過對比高原鼠兔與大鼠在低氧前后外周血及骨髓紅系細胞的變化，初步探討高原鼠兔紅系造血系統低氧適應的形態學變化。 方法：健康野生
摘要背景：生活于高原鼠兔的血液系統中外周血紅細胞及骨髓有核紅細胞數目及形態的變化，對其低氧適應有重要意義。
目的：通過對比高原鼠兔與大鼠在低氧前后外周血及骨髓紅系細胞的變化，初步探討高原鼠兔紅系造血系統低氧適應的形態學變化。
方法：健康野生高原鼠兔及清潔級 SD 大鼠各 12 只，分別隨機分為實驗組和對照組，每組 6 只，實驗組動物飼養在模擬海拔 5 000 m 高原低壓低氧艙內，連續低壓低氧干預 28 d，對照組動物在海拔 2 260 m 的實驗室內飼養。
結果與結論：①對照組高原鼠兔較對照組大鼠紅細胞直徑小而計數多，低氧暴露 28 d 后，兩組實驗動物紅細胞數、血紅蛋白濃度及紅細胞壓積均升高(P < 0.05)，但高原鼠兔增高幅度明顯低于大鼠，且高原鼠兔平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量及平均紅細胞血紅蛋白濃度無明顯變化;②骨髓涂片結果顯示，低氧暴露后高原鼠兔中、晚幼紅細胞比例無明顯變化，但大鼠中、晚幼紅細胞比例顯著增加(P < 0.05);③胸骨蘇木精-伊紅染色結果顯示，低氧暴露后高原鼠兔幼紅細胞島無明顯變化，但大鼠幼紅細胞島明顯增生;④結果顯示，高原鼠兔在低氧暴露前后外周血及骨髓紅系變化幅度明顯低于 SD 大鼠，考慮高原鼠兔長期生活在高原低氧環境下，可能與其低氧適應機制有關。
關鍵詞：高原鼠兔;大鼠;造血系統;骨髓;有核紅細胞;幼紅細胞島;外周血;紅細胞;低氧暴露;低氧適應中圖分類號：R599，R331;R364
0 引言 Introduction
高原鼠兔屬鼠兔科，形小如鼠，廣泛分布于海拔3 000- 5 000 m的高寒草甸及草原地區，高原鼠兔在高原低壓低氧環境下已經生活了3 700萬年以上，是青藏高原上經過無數代的自然選擇后而被保留下來的本土野生動物。通過國內外學者對高原鼠兔的生物習性、生理及遺傳等方面的大量研究，目前認為該動物是研究低氧適應的最佳動物模型[1-2]。既往研究顯示高原鼠兔在血液學上是以紅細胞數量多、低血紅蛋白水平、低紅細胞壓積為主要特征的，其血紅蛋白和紅細胞壓積均明顯低于生活在同一環境中的大鼠[3]，紅細胞計數、血紅蛋白和紅細胞壓積不因海拔高度的增加而發生明顯的改變，大鼠從海拔2 300 m到5 000 m，紅細胞壓積增加了57.3%，而高原鼠兔僅增加了15.8%[4]，高原鼠兔的這種血液學變化使得血紅蛋白攜帶更多的氧到組織中，又不會使血液黏滯度過高從而影響組織灌流。
骨髓是重要的造血器官，其功能是產生造血干細胞，目前對高原鼠兔骨髓造血系統的研究尚屬于空白，實驗利用模擬高原低壓低氧艙，觀察高原鼠兔及大鼠在海拔 2 260 m及模擬海拔5 000 m低壓低氧情況下外周血及骨髓造血系統的變化，初次描述了不同海拔高原鼠兔與大鼠骨髓造血系統紅系形態學特征，為研究高原鼠兔低氧適應機制補充造血系統相關內容。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 設計 隨機對照動物實驗。
1.2 時間及地點 實驗于2018年11月至2019年5月在青海大學高原醫學中心實驗室完成。
1.3 材料
1.3.1 實驗儀器及試劑
低壓低氧艙(貴州風雷機械公司)、全血細胞分析儀(西門子公司，德國)、光學顯微鏡 (Olympus公司，日本)、戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國)、瑞氏-姬姆薩染液(索萊寶公司，北京)、蘇木精-伊紅染色試劑盒(索萊寶公司，北京)、40 g/L多聚甲醛固定液(索萊寶公司，北京)。
1.3.2 實驗動物
高原鼠兔為12只健康野生雄性高原鼠兔，體質量110-150 g，捕捉自中國科學院海北高寒草甸生態系統定位站(37°40′N，101°23′E，海拔3 200 m，氣壓為 6 717 kPa)，捕獲后飼養1周運回西寧地區。另取12只健康的清潔級SD大鼠，均為雄性，購于北京維通利華實驗動物有限公司，動物許可證號：SYXK(京)2017-0022，實驗動物均在西寧地區(海拔2 260 m)飼養4周后用于實驗。
1.4 實驗方法
1.4.1 分組及造模 高原鼠兔和SD大鼠分別隨機分為實驗組和對照組，每組6只。實驗組動物飼養在模擬海拔5 000 m 高原低壓低氧艙內，每日23 h(另有1 h開倉喂食水、換墊料等)，連續低壓低氧28 d;對照組動物在海拔2 260 m的實驗室內飼養。所有動物實驗均獲青海大學附屬醫院倫理委員會批準。
1.4.2 樣品采集
外周血常規檢查及血涂片觀察：實驗動物模擬低氧時間結束后，立即從低壓低氧艙內取出，用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉。腹部皮膚消毒，切開皮膚分離組織，暴露出腹主動脈，用肝素化注射器經腹主動脈采血1 mL于 EDTA抗凝管中。同時每只動物制作血涂片4張，經瑞氏- 姬姆薩染色后在顯微鏡下觀察。
骨髓涂片觀察：實驗動物處死后分離雙后肢股骨和脛骨，剪開長骨兩端，用斷端直接在載玻片上行骨髓推片，每只小鼠同時制作骨髓涂片6張，經瑞氏-姬姆薩染色后在顯微鏡下觀察。
胸骨組織切片觀察：實驗動物處死后分離胸骨，40 g/L 多聚甲醛固定2 d，沖洗后放入體積分數10%脫鈣液1周，每隔2 d換液1次，常規脫水、浸蠟、包埋后進行5 μm連續切片，行蘇木精-伊紅染色后在顯微鏡下觀察。 1.4.3 指 標測 定 采用 全自 動 血細 胞 分析 儀 ( 美 國 Bio-Rad公司)測定紅細胞數、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量及平均紅細胞血紅蛋白濃度等紅細胞指標。
外周血涂片：由2名高年資形態學醫師觀察，選取頭體尾分明，厚薄適宜，制片及染色均良好的涂片觀察紅細胞形態，隨機選取紅細胞，采用Mshot軟件測量紅細胞直徑。
骨髓涂片：在低倍鏡下觀察骨髓增生程度，油鏡下觀察骨髓各系細胞形態，分類計數200個有核細胞并計算出紅系各階段的百分率，分別由2名高年資形態學醫師觀察后取平均值。
胸骨組織切片：應用蘇木精-伊紅染色法，其中蘇木精能將細胞核內的染色質染成紫藍色，而伊紅能將細胞質及細胞外基質染成紅色，染色后能夠區分出細胞的形態。 1.5 主要觀察指標 低氧暴露28 d前后實驗動物血常規各項指標測定、外周血細胞、骨髓紅系造血細胞及胸骨組織蘇木精-伊紅染色形態。
1.6 統計學分析 通過SPSS 17.0軟件進行數據統計分析，數值均為正態分布，計量資料以x _ ±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用獨立樣本t 檢驗，統計學顯著性水平為P < 0.05。
2 結果 Results
2.1 實驗動物數量分析 納入高原鼠兔和SD大鼠12只，均進入結果分析，無死亡和感染，無脫失值。
2.2 低氧暴露28 d前后實驗動物外周血測定結果外周血涂片觀察結果：
各組取材、涂片、染色良好，每組實驗動物紅細胞形態正常。對照組高原鼠兔的紅細胞直徑為(6.70±0.65) μm，大鼠紅細胞直徑為(8.20±0.68) μm，高原鼠兔的紅細胞體積小于大鼠，低氧28 d后兩組實驗動物外周血涂片紅細胞體積及形態等在顯微鏡下觀察未見明顯變化，
血常規各項指標測定結果：低氧28 d后，高原鼠兔紅細胞數、血紅蛋白濃度及紅細胞壓積等指標較對照組升高 (P < 0.05)，但平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量及平均紅細胞血紅蛋白濃度兩者間均無顯著性差異(P > 0.05);低氧28 d后大鼠紅細胞相關指標較對照組均有不同程度升高，且升高幅度明顯高于高原鼠兔，
2.3 低氧暴露28 d前后實驗動物骨髓造血系統變化情況各組取材、涂片、染色良好，紅系增生，各階段細胞形態大致正常，見圖2。高原鼠兔低氧28 d組中幼[(12.33±1.37)%]，晚幼[(18.66±2.54)%]紅細胞占有核細胞比例較對照組中幼[(12.16±3.75)%]、晚幼[(17.33±3.17)%]紅細胞比例無顯著差異 (P > 0.05) ;大鼠低氧 28 d 組 中 幼 [(20.17±1.57)%]、晚幼[(19.00±2.79)%]紅細胞占有核細胞比例明顯增高，與對照組大鼠中幼[(7.00±1.79)%]、晚幼 [(11.17±0.52)%]紅細胞對比有顯著性差異(P < 0.05)，兩組實驗動物低氧28 d前后原始紅細胞及早幼紅細胞比例兩者之間均無顯著性差異(P > 0.05)，見圖3。粒系增生，各階段細胞形態大致正常。
2.4 胸骨組織蘇木精-伊紅染色形態 高原鼠兔對照組及低氧28 d組骨髓增生均活躍(約90%)，兩組紅系各階段可見，均以中晚幼紅細胞增生為主;粒系各階段可見，均以中幼及以下階段細胞增生為主，嗜酸性粒細胞較易見，形態未見明顯異常;巨核細胞數量大致正常，以分葉核增生為主。大鼠對照組及低氧28 d組骨髓增生均活躍(約90%)，紅系各階段可見，以中晚幼紅細胞增生為主，大鼠低氧28 d 組較對照組可見較多幼紅細胞灶性分布(幼紅細胞島);大鼠對照組巨核細胞數量大致正常，以分葉核增生為主，而低氧28 d組巨核細胞數量明顯增多，散在及小簇狀分布。
推薦閱讀：動物實驗論文投什么期刊雜志
3 討論 Discussion
實驗研究結果表明，低氧暴露28 d后高原鼠兔及大鼠紅細胞相關指標變化各有不同。在海拔2 260 m高原鼠兔相比于同海拔大鼠紅細胞數目多、體積小，但紅細胞壓積和血紅蛋白含量兩者相近，這些結果與先前的報道一致[5]。低氧28 d后高原鼠兔和大鼠的紅細胞數、血紅蛋白和紅細胞壓積均有所增高，但高原鼠兔血紅蛋白增高幅度明顯低于大鼠，且高原鼠兔紅細胞體積無明顯變化，這與以往認為高原鼠兔低氧暴露后平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量及平均紅細胞血紅蛋白濃度均低于常氧的結論不一致[6]。實驗動物對低氧的血液學代償反應主要表現為紅細胞數增多、血紅蛋白含量升高及紅細胞壓積增加，這是機體在低氧環境中提高攜氧能力的適應對策，這種變化增加了紅細胞的表面積，有利于氧的彌散，能夠使血紅蛋白攜帶更多的氧到組織中[7-8]。實驗中，低氧暴露28 d后高原鼠兔紅細胞體積相關指標無明顯變化，而大鼠明顯增高，表明大鼠為了適應高原低氧環境增加紅細胞數量與體積從而增加攜氧量。高原鼠兔紅細胞體積小，當海拔升高時，紅細胞數量代償性增多，但體積無明顯變化，有助于減少血液循環阻力，這比大鼠低氧應激后同時增加紅細胞數目與體積，從而增加血液循環阻力產生不良影響有利，這是高原鼠兔在血液方面適應高原的主要特征，此結果與高原世居人群和其他動物是一致的[9-11]。高原鼠兔對低氧的適應機制與大鼠雖有相同之處，但明顯優于大鼠，這也無疑是高原鼠兔適應高原低氧環境的有利機制。
高原土著動物經過長期的進化和自然選擇后具有適應低氧的能力，在血液學上表現為血紅蛋白結合、釋放氧的能力明顯高于平原動物，這對低氧時體內氧的傳遞是有利的[12-13]。與平原動物相比，高原土著動物氧解離曲線左移，血紅蛋白對氧的親和力增加，使得PO2和SO2水平增高，另外，其氧解離曲線的中段較陡，有利于氧在肺部的運輸與釋放，便于組織臟器獲取更多的氧[14-15]。
骨髓是重要的造血器官，其功能是產生造血干細胞，這些造血干細胞增殖、分化、成熟形成各種血細胞如紅細胞、白細胞及血小板[16]。已知文獻中尚未發現對高原鼠兔骨髓造血細胞變化的相關研究。實驗首次觀察了低氧28 d 前后高原鼠兔和大鼠骨髓涂片及胸骨組織切片中有核紅細胞變化，結果表明，對照組高原鼠兔骨髓中有核紅細胞比例及幼紅細胞島較對照組大鼠增多，低氧暴露28后高原鼠兔骨髓中有核紅細胞比例及幼紅細胞島無明顯變化，但大鼠在低氧暴露后骨髓中上述指標較對照組明顯增多。骨髓中的紅系造血活動活躍，導致外周血紅細胞增多。既往對比高原移居與世居者的骨髓象，結果顯示移居者的骨髓紅系增生明顯，以晚幼紅細胞增生為主，而世居者的骨髓象則與平原健康人骨髓象相似[17]。
高原低氧適應動物骨髓組織中有核紅細胞增加的現象可能與體內促紅細胞生成素等調節激素的作用有關[18]，當機體低氧時，體內促紅細胞生成素增多[19-20]，刺激骨髓原始紅細胞增多，加速其分化為有核紅細胞，促進紅細胞成熟，進而使得外周血中的紅細胞增多[21]。另外，骨髓紅系增生活躍，致外周血紅細胞過量，同時巨噬細胞因缺氧、胞質水腫，吞噬紅細胞功能減弱，從而導致骨髓中有核紅細胞及外周血中紅細胞破壞減少，使其數目增多[22-23]。
在低氧應激下，缺氧誘導因子1α能夠轉錄調控促紅細胞生成素、血管內皮生長因子等靶基因的表達，刺激紅細胞生成與成熟，增強血管再生[24]。XIE等[1，25]報道，當鼠兔暴露于低氧環境時骨骼肌中缺氧誘導因子1α和血管內皮生長因子對低氧應激的反應減弱。實驗中，在海拔2 260 m 時高原鼠兔骨髓有核紅細胞數目較同海拔地區大鼠偏高，但當加重低氧程度后其骨髓有核紅細胞無明顯變化，可能與高原鼠兔骨髓組織對低氧反應的鈍化有關，是否與骨髓組織中低氧相關基因的表達有關有待進一步驗證。
實驗比較了高原鼠兔和大鼠暴露于模擬海拔5 000 m的低壓低氧環境28 d前后的血液系統變化，結果表明對照組中高原鼠兔較大鼠紅細胞數量多而體積小，低氧暴露28 d后，高原鼠兔和大鼠的紅細胞計數、血紅蛋白和紅細胞壓積均升高，但高原鼠兔的升高水平明顯低于大鼠，且紅細胞體積無明顯變化，這與以往的研究結果不甚一致，提出了新的結論。同時實驗首次對高原鼠兔和大鼠在低氧環境下骨髓造血系統有核紅細胞的形態學變化做了詳細的對比，結果表明低氧暴露28 d后高原鼠兔骨髓紅系無明顯變化，但大鼠骨髓紅系明顯增生。這些發現為將來深入研究高原土著動物以及高原適應人群造血系統的低氧適應機制奠定了基礎。
SCISSCIAHCI
