發(fā)布時間：2020-01-11所屬分類：醫(yī)學論文瀏覽：1次
摘 要： 【摘要】毛細管電泳是一種新型的分析技術，具有高柱效、高選擇性、快速分離、低溶劑消耗、分離模式多等特點。其應用涉及到分析領域的各個方面，尤其對藥物的分析有著特有的貢獻。頭孢類抗生素作為抗生素的重要分支，一直以來是藥物分析的重點和熱點之一。本
【摘要】毛細管電泳是一種新型的分析技術，具有高柱效、高選擇性、快速分離、低溶劑消耗、分離模式多等特點。其應用涉及到分析領域的各個方面，尤其對藥物的分析有著特有的貢獻。頭孢類抗生素作為抗生素的重要分支，一直以來是藥物分析的重點和熱點之一。本文選取十種頭孢類抗生素或前體為供試樣品，以CZE模式，檢測波長為195nm，緩沖液為40mmol/L磷酸鹽(Na2HPO4+NaH2PO4，pH為7.0)，總柱長為65cm，有效柱長為45cm，柱內(nèi)徑50μm，分離電壓為-15kV，重力進樣，以此建立了一種高效毛細管電泳的分析方法并對其進行了方法學驗證。該方法表明，十種供試樣品可在20分鐘內(nèi)實現(xiàn)基線分離。本方法簡單有效，為頭孢類抗生素類抗生素的分離分析提供了一種新的借鑒模式。
【關鍵詞】毛細管電泳，頭孢類抗生素，方法開發(fā)
毛細管電泳，又叫高效毛細管電泳(HPCE)，是八十年代問世的一種高效的液相分離方法，是經(jīng)典電泳技術和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物，它已成為分析化學新興的一個分支學科[1]。毛細管電泳具有分析時間短，分離效率高，溶劑消耗少的特點。柱的效率通常達到105～107理論塔板/米。毛細管電泳有六種不同的分離形式：毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細管凝膠電泳(CGE)、膠束電動毛細管色譜(MEKC)、毛細管等電聚焦(CIEF)、毛細管快速電泳(CITF)以及毛細管電色譜(CEC)模式等。CZE是毛細管電泳中使用最廣泛，最基本的分離方式。其應用包括無機離子，小分子氨基酸、多肽以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)。此外，通過向緩沖溶液中加入手性添加劑，一些對映體也能夠被分離。頭孢菌素類抗生素的pKa一般在2～5，當緩沖溶液的pH值大于5時，這些頭孢菌素類抗生素化合物將帶負電。因此，頭孢類抗生素可以通過高效毛細管電泳來分離。本實驗選取十種頭孢類抗生素或前體作為供試樣品，通過對毛細管電泳條件的優(yōu)化，建立了分析頭孢菌素抗生素的高效毛細管電泳的分離方法并對其進行了方法學驗證。
1 儀器與試劑
1.1儀器
CE：型號CE-1000，UnimicroTechnologies生產(chǎn)。pH計：型號PB-10，北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)。超聲波清洗器：型號KQ2200B，昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn)。電子天平：型號FA1004，上海恒平科學儀器有限公司生產(chǎn)。紫外分光光度計：型號LAMBDA25，PekinElmer生產(chǎn)
1.2試劑
純化水：UnimicroTechnologies臨用新制。甲醇：級別HPLC，SCRC生產(chǎn)。Na2HPO4：級別AR，SCRC生產(chǎn)。NaH2PO4：級別AR，SCRC生產(chǎn)。乙腈：級別HPLC，Merck生產(chǎn)。
1.3實驗對照品
所有實驗對照品均來自于中國食品藥品檢定研究院，開瓶有效期均為2018年12月10日，所有對照品均為2～8℃保存。頭孢克肟(含量：100%，批號：130503-201706)頭孢氨芐(含量：100%，批號：130408-201411)，7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(含量：100%，批號：130416-201006)，頭孢呋辛(含量：100%，批號：130493-201706)，7-氨基頭孢烷酸(含量：100%，批號：130538-200902)，頭孢哌酮(含量：93.8%，批號：130420-201105，頭孢他啶(含量：100%，批號：130484-201205)，頭孢吡肟(含量：100%，批號：130524-201404)，頭孢噻肟(含量：92.2%，批號：130483-201505)，頭孢拉定(含量：88.4%，批號：130427-201708)。
2 頭孢類抗生素的高效毛細管電泳分離方法的建立
2.1檢測波長的選擇
取實驗對照品，分別配制成含各成分均約10μg/mL的紫外掃描溶液，分別于190～500nm下做紫外掃描，得出全波長掃描圖譜。依照毛細管電泳波長選擇的原則，在基質(zhì)不干擾的情況下取最大靈敏度的波長，故選擇195nm為測試波長。
2.2緩沖液的選擇
根據(jù)各化合物的理化性質(zhì)，頭孢拉定pKa1(2.63)，頭孢氨芐的pKa1=5.2以及其他的化合物的總pKa值范圍在1.62～5.2，并存在一定的梯度。從pKa與pH的關系考慮，若化合物能得到良好的分離，即是說明pH至少為6.8以上。磷酸鹽緩沖6.2～8.2，故選擇磷酸鹽緩沖液。緩沖液以Na2HPO4+NaH2PO4配制方式最容易重現(xiàn)。電滲流從pH=8開始下降。此時會使分析時間加長。再者頭孢類在堿性條件中的穩(wěn)定性不佳，故pH選擇范圍初步設定為6.8～8。實驗結(jié)果顯示，pH=7.0時分離效果最好。
2.3緩沖液濃度的選擇
緩沖液濃度對峰形和出峰時間有較大影響。選擇磷酸鹽緩沖液濃度分別為30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L對方法進行考察。選擇40mmol/L的濃度，因其可以達到更為理想的分離度，且分離時間在20min以內(nèi)。
2.4毛細管長及內(nèi)徑
為調(diào)整分離度增加柱長是有限度的。本次實驗選擇三個柱長，分別是柱長1：總長為70cm(其中有效長度為50cm)，柱長2：總長為=65cm(其中有效長度為50cm)，柱長3：總長為65cm(其中有效長度為45cm)。其中柱長3能達到更加理想的分離度，效果明顯好于其他柱長。
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不同內(nèi)徑大小的毛細管會對分析物的分離產(chǎn)生一定的影響，本實驗分別考察50μm和75μm的毛細管柱。實驗結(jié)果表明，內(nèi)徑為50μm的毛細管的柱效要比內(nèi)徑為75μm的高，供試樣品能夠在在20分鐘以內(nèi)得到基線分離，因此，我們選取50μm內(nèi)徑的毛細管。
2.5電壓的選擇
在一定范圍內(nèi)，增加分離電壓可以改善相鄰組分間的分離，而焦耳熱限制了過高電壓的使用。這里考察-15kV和-20kV的電壓。-15kV耗能少，操作安全，焦耳熱明顯少于-20kV。
故綜合2.1～2.5，最優(yōu)化的分離條件是在CZE模式下，檢測波長195nm，緩沖液為40mmol/L磷酸鹽(Na2HPO4+NaH2PO4)，pH7.0，柱長65cm(其中有效柱長為45cm)，柱內(nèi)徑50μm，分離電壓-15kV。分離效果見圖1。
3 頭孢類抗生素的高效毛細管電泳分離方法的驗證
3.1線性
配制10種頭孢類抗生素對照品混合儲備溶液，使其濃度分別為100.0µg/mL。取該溶液逐步稀釋，稀釋最終線性濃度為六個級別：化合物LOQ，濃度1:3.0µg/mL，濃度2:4.0µg/mL，濃度3:5.0µg/mL，濃度4:10.0µg/mL，濃度5:20.0µg/mL。
在經(jīng)優(yōu)化的色譜條件下進行測試，得到一系列響應的數(shù)據(jù)，繪制校準曲線，得出線性回歸方程和檢測限。見表1。
3.2精密度實驗取
3.1中的濃度3(5.0µg/mL)溶液，重復進樣6針，考察各化合物的峰面積及遷移時間RSD。
峰面積RSD結(jié)果：頭孢克肟、頭孢氨芐、7-ADCA、頭孢呋辛、7-ACA、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢拉定依次分別為8.60%、7.60%、6.50%、5.90%、9.70%、6.30%、7.30%、6.80%、5.40%、7.30%。
遷移時間RSD結(jié)果：頭孢克肟、頭孢氨芐、7-ADCA、頭孢呋辛、7-ACA、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢拉定依次分別為2.60%、2.40%、1.20%、2.50%、2.30%、2.00%、2.60%、2.80%、2.60%、2.70%。
結(jié)果顯示，所有化合物的峰面積RSD在5.4%～9.7%，遷移時間的RSD在1.2%～2.8%。說明該方法完全滿足CE方法驗證的要求，即遷移時間RSD小于3%，峰面積RSD小于10%。
4 結(jié) 論
本文在仔細研究了十種目標物的理化性質(zhì)后，確認了毛細管電泳可分離分析十種頭孢類抗生素，并隨即成功開發(fā)了一套耗時短、操作方便快捷、經(jīng)濟環(huán)保的頭孢類抗生素的分析方法并成功驗證。該方法分離時間短且峰形良好，各組分能夠被基線分離。方法驗證結(jié)果說明，各組分線性良好，相關系數(shù)(r)均大于0.990;在平行進樣六針下，遷移時間的RSD均小于3.0%，峰面積的RSD均小于10%。此外，該方法的檢測限和定量限也滿足樣品檢測的需求。
